银杏传粉滴分泌、成分及在传粉中功能研究

发布时间：2020-04-05 16:18

【摘要】：传粉滴(Pollination drops,PD),是裸子植物胚珠产生的分泌物。传粉滴参与花粉捕获、萌发和受精过程,是大多数裸子植物传粉系统的重要组成部分。前人对裸子植物传粉滴的分泌和功能已有较为深入的研究,然而对于传粉滴中的化学成分以及分泌的分子机制研究则较少。此外,在动物的外泌体中检测到miRNAs,称为细胞外miRNA(Extracellular miRNAs),但植物中是否也存在ExtracellularmiRNAs尚未有报道。本研究以银杏传粉滴为研究对象,通过高通量sRNA测序和GS-MS技术,检测出传粉滴中含有大量代谢产物,并鉴定到miRNAs。进一步采用转录组学、小RNA组学及分子生物学等,探究参与调控传粉滴分泌的分子机制,主要取得以下结果:(1)银杏传粉滴中的成分主要为糖,包括葡萄糖等单糖,以及蔗糖、麦芽糖、乳糖等二糖,共23种,占总物质45.70%;其次为有机酸,包括葡庚糖酸、丙酮酸、乳酸等共18种,占15.94%;木糖醇、山梨醇和肌醇等13种醇类,占15.39%;以及类黄酮和萜类等次生代谢物共19种,占11.94%。这些代谢产物主要参与半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等通路。(2)采用稀释后的传粉滴培养银杏花粉,培养24 h后花粉脱外壁,48 h后,部分花粉开始萌发产生花粉管,说明银杏传粉滴中含有促进花粉萌发的物质。根据传粉滴成分,进一步配置分别添岩藻糖、麦芽糖、山梨糖,以及按传粉滴中蔗糖、葡萄糖和果糖比例配置的培养基进行花粉培养实验,花粉虽可吸水膨胀且积累淀粉粒,但均未萌发形成花粉管,表明不同于被子植物和其他裸子植物,银杏花粉萌发难,时间长,须在传粉滴的条件下才能正常萌发生长,但传粉滴中具体哪些成分是花粉管萌发生长的必须物质尚需要进一步深入研究。(3)采用常规培养基培养银杏花粉,48 h天后开始染菌;根据传粉滴成分添加绿原酸后,96 h天后部分染菌;而添加月桂酸、乳酸和马来酸的培养基可显著抑制污染。OD600数据分析同样显示乳酸、马来酸和月桂酸单甘油酯的数值较低,表明银杏传粉滴中的月桂酸、乳酸和马来酸在花粉离体培养中具有显著抑菌功能。(4)传粉滴小RNA测序分析,共检测到45个已知miRNAs和550个新的miRNAs。通过RT-PCR和qRT-PCR进一步验证4个已知miRNAs在传粉滴中有表达,表明传粉滴中存在miRNAs。潜在靶点分析表明,miRNAs可能参与碳水化合物代谢、激素信号、次生代谢产物的生物合成和防御反应等,这些功能与代谢组学结果一致。进一步比较传粉滴和胚珠中miRNAs的表达量发现,几乎所有传粉滴中已知的miRNAs都在胚珠中表达,且有些miRNAs的表达量高于胚珠,暗示着传粉滴中的miRNAs一部分可能来源于胚珠。(5)传粉前后胚珠高通量测序鉴定到可能与分泌相关的差异基因Gb_23187,以及与淀粉代谢相关的差异基因,如Gb_32465、Gb_05693和Gb_28387,在授粉后表达量均下调。小RNA组学分析进一步明确了 miR1083、miR858b和miR858a可能参与调控分泌,而ptc-miR319i、miR159f、miR166d-5p 等 12 个 miRNAs 可能参与调控淀粉代谢。(6)传粉滴分泌旺盛期,赤霉素信号通路中的基因Gb_11704和赤霉素合成相关的基因Gb_05787、Gb_16591等上调表达;茉莉酸信号通路的负调控基因Gb_17431和Gb_17432下调表达,而Gb_39942、Gb_03931、Gb_18696等与茉莉酸合成相关的差异基因均上调表达。外源喷施试验进一步证明100 μM茉莉酸甲酯和短时间的赤霉素处理均可有效促进传粉滴的分泌,说明茉莉酸和赤霉素可能参与调控银杏传粉滴的分泌。(7)通过与其他物种中的分泌基因进行进化树分析,鉴定到一些可能参与银杏胚珠分泌的基因,包括Gb_15814、Gb_19348和Gb_23187,qRT-PCR显示,3个基因在传粉滴分泌期上调表达,而在授粉后表达量下降。进一步克隆这些基因并构建过表达载体,瞬时转化烟草,激光共聚焦显微镜下可观察到Gb_15814、Gb_19348主要定位于细胞质膜中,而Gb_23187在细胞质膜和细胞核中均有定位。关于这三个可能与分泌相关的基因的功能验证尚需进一步深入研究。
【图文】：

技术路线图,传粉滴,扬州大学,硕士学位论文

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传粉滴,银杏,枝条,采集模式

第三章结果与分析逡逑３．１银杏传粉滴成分分析逡逑为检测银杏传粉滴中的成分，采集带有胚珠的银杏枝条进行实验室水培（图３－ｌａ，，邋ｂ），逡逑至传粉滴的体积达到最大时（图３－１邋ｃ，ｄ），使用移液枪收集至２００邋ｐＬ的离心管中（图３－１邋ｅ）。逡逑＇Ｖ１逦；逡逑Ｉ邋Ｐｔｉｙ逦Ｉ逡逑：Ａ邋—．逦！逡逑逦邋：逦：逦ｒｙ：逦，逡逑图３－１银杏传粉滴的收集逡逑（ａ）试验田中带有胚珠的银杏枝条；（ｂ）实验室内水培银杏枝条；（ｃ，ｄ）银杏传粉滴的分泌；（ｅ）银杏传粉逡逑滴采集模式图．ＯＶ：胚珠；ＰＤ：传粉滴逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ邋ｄｒｏｐｓ邋ｏｆ邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ逡逑（ａ）邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ邋ｂｒａｎｃｈｅｓ邋ｗｉｔｈ邋ｏｖｕｌｅｓ；邋（ｂ）邋Ｈｙｄｒｏｐｏｎｉｃ邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ邋ｂｒａｎｃｈｅｓ邋ｉｎ邋ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；邋（ｃ，邋ｄ）邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ逡逑ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ邋ｄｒｏｐｓ；邋（ｅ）邋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ邋ＰＤｓ邋ｏｆ邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ．邋ＯＶ：邋Ｏｖｕｌｅ；邋ＰＤ：邋ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ邋ｄｒｏｐ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.95

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