毛果杨C2H2型锌指蛋白基因PtZFP103功能研究

发布时间：2020-07-16 13:18

【摘要】：C2H2型锌指蛋白转录因子是植物中转录因子家族,参与植物正常生长发育的各个进程,如调节植物器官生长、促使毛状体初始化、控制根的分生组织和叶片的极性等;同时参与植物的生物和非生物胁迫下逆境应答反应,如低温、干旱、高盐及病原体防御等,在植物抗逆过程中发挥着重要作用。目前,木本植物中的相关C2H2型锌指蛋白基因少有报道,本文对毛果杨中该家族的基因PtZFP103进行初步的功能分析及逆境下其启动子的表达特性。结果如下:(1)对毛果杨根和叶在NaCl、mannitol、ABA、SA和MeJA处理下的不同时间点(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和7d)表达模式进行了分析,发现PtZFP103基因在各种胁迫下的表达量均有不同变化,其中在NaCl和干旱胁迫下基因在根和叶中的表达量提高较为显著。从毛果杨中克隆出PtZFP103基因,对其核定位及转录激活区进行研究,研究发现其在细胞核中表达,且其转录激活区位于蛋白质C端的379-507氨基酸区段。(2)利用PlantCare对PtZFP103基因启动子元件进行分析预测,发现其启动子区域含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats和ABA应答元件ABRE等。构建植物克隆载体pBI121-PtZFP103-GUS,用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。将转基因拟南芥植株进行不同胁迫下GUS表达活性分析,发现其在NaCl、mannitol、ABA、SA和MeJA胁迫下GUS表现出较高的表达活性,且具有组织表达特异性。说明PtZFP103基因可能在逆境胁迫下参与胁迫响应应答。(3)将过表达载体利用农杆菌介导的花侵染法转化到拟南芥中。通过在盐和干旱胁迫条件下种子的萌发率和幼苗根长鲜重的分析比较,发现过表达PtZFP103基因能够提高拟南芥耐盐抗旱能力。通过NBT、DAB、Evans Blue染色、MDA、SOD、POD各项生理指标的观察研究发现,在盐胁迫条件下,PtZFP103基因的过表达拟南芥细胞受损程度明显低于野生型拟南芥,SOD和POD活性明显高于野生型。这些结果表明PtZFP103基因的过表达拟南芥可能启动了抗氧化酶酶促防御系统来提高耐盐性。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S792.11
【图文】：

图２－１毛果杨基因户／ＺＦＰ／０３与其他物种进化树的构建逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＰｔＺＦＰ１０３邋ａｎｄ邋ｇｅｎｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｏｔｈｅｒ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑

逡逑图２－３毛果杨ＲＮＡ条带和ｃＤＮＡ检测电泳图逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ｃＤＮＡ逡逑２、Ｐ／ＺＦＰ／ＯＪ基因的克隆逡逑将反转录成功的ｃＤＮＡ稀释１０倍作为ＰＣＲ反应模板。根据乃ＺＭ川Ｊ基因全逡逑长序列所设计出的引物进行目的条带扩增，长度为５０７邋ｂｐ如图２－４。将目的条带扩增逡逑后进行胶回收，产物连接到ＰＭＤ１８－Ｔ载体，随机挑取单克隆进行菌液ＰＣＲ检测，凝逡逑胶电泳检测后观察条带是否正确如图２－５，若大小与目的条带相同则送去测序，测序结逡逑果需与官网所查序列完全一致，说明克隆成功。逡逑Ｍ邋１逦１逡逑７５０邋ｂｐ邋一？邋Ｋ逡逑图２－４八ＺＦＰ／Ｗ克隆产物逡逑Ｆｉｇ．邋２－４邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＰｔＺＦＰ１０３逡逑Ｍ：邋ＤＮＡＭａｒｅｋｅｒＤＬ２０００；邋１：邋ＰｒＺＦＰｍ？克隆产物逡逑Ｍ邋１逦２逡逑ｍ逡逑７５０邋ｂｐ—邋■逡逑５００邋ｂｐ—ｆ逡逑图邋２－５邋菌液邋ＰＣＲ邋检测邋ｐＭＤ１８－Ｔ－邋ＡＺＦ／ＶＷ逡逑Ｆｉｇ．邋２－５邋Ｔｈｅ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ｐＭＤ１８－Ｔ－邋ＰｔＺＦＰ１０３邋ｕｓｉｎｇ邋ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡＭａｒｅｋｅｒＤＬ２０００；邋１－２：含邋ＰＭＤ１８－Ｔ－Ｐ／２ＦＰ７０５邋大肠杆菌单菌落逡逑２．３．３过表达载体ｐＢＩ１２１－／Ｗ７＾－ＧＦＰ的构建逡逑以ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ／ＺＦＰ／０Ｊ阳性质粒为模板，酶切引物进行ＰＣＲ扩增，电泳检测结果逡逑如图２－６所示。看出５０７邋ｂｐ处有明亮的单一条带

Ｍ：邋ＤＮＡＭａｒｅｋｅｒＤＬ２０００；邋１：尸酶切引物邋ＰＣＲ邋产物逡逑对胶回收产物和ｐＢＩ１２１－（＾ＦＰ质粒同时进行双酶切。将两个酶切产物分别纯化后连逡逑接，然后转入大肠杆菌。菌液ＰＣＲ结果如图２－７所示，条带与目的片段大小一致，亮逡逑度明显大于Ｍａｋｅｒ，初步表明连接成功，同时选３个阳性克隆送公司测序。逡逑Ｍ邋１逦２逦３逡逑７５０邋ｂｐ—＾逦ｚ邋多逦，、逡逑５００邋ｂｐ邋—Ｉ逡逑图邋２－７邋菌液邋ＰＣＲ邋检测邋ＰＢＩ１２１－Ｐ⑵＾／０５－ＧＦＰ逡逑Ｆｉｇ．邋２－７邋Ｔｈｅ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ｐＢ＼＼２＼－ＰｔＺＦＰ１０３－ＧＦＰ邋ｕｓｉｎｇ邋ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡＭａｒｅｋｅｒＤＬ２０００；邋１－３：含邋ｐＢ１１２１－凡Ｚ仲７０３－ＧＦＰ邋大肠杆菌单菌落逡逑测序后的比对结果证明过表达载体ｐＢＩ１２１－竹ＺＦＰ川５－ＧＦＰ构建成功，然后将其转入逡逑农杆菌ＥＨＡ１０５中，挑取单菌落后进行菌液扩增，用其质粒为模板ＰＣＲ检测，结果如逡逑图邋２－８。逡逑Ｍ邋１逦２逦３逡逑７５０邋ｂｐ—邋＾逡逑５００邋ｂｐ—？邋Ｉ逡逑－１６－逡逑

【参考文献】

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本文编号：2758046