杨树茎尖小RNA组学和种子萌发技术研究

发布时间：2020-09-14 20:18

　　 杨树易繁殖、生长迅速,是世界上广泛栽培的重要用材树种。杨树全基因组已被测序,成为林木科学研究的模式树种。林木地上部分的生长主要来自于茎尖分生组织(shoot apical meristems,SAM)的发育分化。茎尖分生组织是位于植物顶端具有持续分化能力的组织,通过细胞分裂、分化产生茎、叶和花等器官。植物茎尖分生组织的分化进程由复杂的基因网络调控,目前关于木本植物的SAM研究主要集中在激素和转录水平调控,而有关SAM转录后水平研究尚未见报道。miRNAs是一类重要的转录后水平调控因子,其参与SAM生长发育的相关调控机制却不清楚。本研究中,以毛白杨(Populus tometosa)不同生长阶段的茎尖分生组织为主要研究对象,以茎尖分化形成的叶片为对照,采用高通量测序方法构建茎尖分生组织和叶片的小RNA数据库,进行比较研究分析。此外,除茎尖分生组织外,种子萌发是林木树种生长发育以及有性繁殖的重要基础,然而不同外界因素对杨树种子萌发影响的研究报道却较少。因此,本论文也研究了不同外界环境因素对杨树种子萌发的影响。主要结果如下:(1)在茎尖和叶片中分别获得11,321,446和11,926,435个clean reads,文库中的小RNA序列长度主要分布18nt到30nt之间,且主峰值在21nt处,符合被子植物典型miRNAs长度分布。(2)比对miRBase数据库分别获得茎尖和叶片中已知miRNAs共计231和256种。同时,在杨树茎尖和叶片中,分别预测到185和181个新miRNAs。(3)根据杨树全基因组序列、应用生物信息学网站程序psRobot和TargetFinder进行靶基因预测。结果表明,已知miRNAs预测到1796个靶基因,新miRNAs预测到1507个靶基因。这些靶基因的功能均主要集中在蛋白结合、细胞进程和催化活性等通路上。(4)对于差异表达miRNAs的分析,与叶片比较,已知miRNAs中茎尖上调的有14个,下调的有54个;新miRNAs中茎尖上调的有27个,下调的有30个。进一步对差异表达miRNAs的靶基因进行功能注释,结果表明已知miRNAs中茎尖表达量上调miRNAs的靶基因功能主要集中在光敏色素互作、叶片着色和叶形态建成等途径;茎尖表达量下调miRNAs的靶基因功能主要集中在细胞分裂分化、生长素响应和细胞分裂素响应等与激素响应有关的途径。同时,新miRNAs中茎尖表达量上调miRNAs的靶基因功能主要集中在捕光叶绿素合成和叶绿素酸酯a加氧酶等与光合作用相关的的途径;茎尖表达量下调miRNAs的靶基因功能主要集中在RNA聚合酶等途径。这些结果表明,茎尖在发育过程中,可通过激素相关miRNAs负向调控其靶基因,进而影响植株的生长发育。(5)ptc-miR166 家族成员中 ptc-miR166n、ptc-miR166o 和 ptc-miR166q 在茎尖分生组织中均显著下调,并靶向多个与细胞分裂分化相关的Ⅲ型H(class ⅢHOMEODOMAIN-LEUCINEZIPPER)转录因子家族成员。进一步进行q RT-PCR实验发现,ptc-miR166及其靶基因HD-ZIP在分化过程中,表达量呈现出相反趋势,表明HD-ZIP可能是ptc-miR166的目标靶基因,ptc-miR166通过负反馈调控HD-ZIP转录因子在茎尖分生组织中起到重要调控作用。(6)ptc-miR393 家族成员中 ptc-miR393a、ptc-miR393b 和 ptc-miR393c 在茎尖中均显著下调,并靶向多个与生长素响应相关的TRI1(transportinhbitorresponse1)转录因子。荧光定量结果表明,ptc-miR393及其靶基因TRI1在发育过程中,表达量呈现出相反趋势,说明TRI1可能是ptc-miR393的目标靶基因,ptc-miR393通过负反馈调控TRI1转录因子在生长素响应过程中起到关键作用。(7)以毛白杨种子为实验材料,研究不同温度、盐分、pH值和光照强度对毛白杨种子萌发的影响。毛白杨种子在昼夜温度为23℃/18℃时,种子发芽率最高。同时,种子发芽能力明显受盐胁迫影响,发芽率随盐浓度的增加而下降。此外,酸碱度也可影响种子萌发,种子在中性环境下萌发率最高。在一定光照强度下,种子的发芽率会随着光照强度的增加而增加,表明光照促进种子的萌发。本研究以毛白杨茎尖分生组织和叶片为材料,建立了两个小RNA文库,筛选出差异表达的miRNAs,并且结合预测获得的靶基因及靶基因功能注释,运用荧光定量PCR技术,研究了 miRNAs与预测靶基因的表达关系及其在毛白杨茎尖分化与发育过程中的功能。同时,使用不同外界环境因素对毛白杨种子进行处理,研究了种子萌发的环境影响因素。研究结果有助于揭示杨树茎尖分生组织分裂、分生的miRNAs调控机制,以及适宜杨树种子萌发的环境因子,为毛白杨茎尖生长分化的基础研究和播种应用技术提供理论依据和实践参考。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S792.11
【部分图文】：

茄茎尖环境扫描电镜图：ａ．茎尖细胞组织分区图；ｂ．生长素（ＡＵＸＩＮ）空间梯度分布图；ｃ．细胞分裂素逡逑（ＣＴＫ）空间梯度分布图；Ｐ１．新萌发叶片区域；Ｐ２．其次萌发叶片区域；Ｐ０．即将形成新叶原基区域．逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｓｐａｔｉａｌ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｘｉｎ邋ａｎｄ邋ｃ＾ｏｋｉｎｉｎ邋（ＣＴＫ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｈｏｏｔ邋ｔｉｐ邋（ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋ｆｒｏｍ邋Ｒｅｆ．邋［３５］）．逡逑ｈｅ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋（ＳＥＭ）邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ａ邋ｔｏｍａｔｏ邋ＳＡＭ：邋ａ．邋Ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ＳＡＭ；邋ｂ．邋Ｔｈｅ逡逑ｓｐａｔｉａｌ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｘｉｎ；邋ｃ．邋Ｔｈｅ邋ｓｐａｔｉａｌ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ邋（ＣＴＫ）；邋Ｐｌ．邋Ｔｈｅ邋ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ逡逑ｕｎｇｅｓｔ邋ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ邋ｌｅａｆ；邋Ｐ２．邋Ｔｈｅ邋ｎｅｘｔ邋ｏｌｄｅｓｔ邋ｌｅａｆ；邋ＰＯ．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｇｉｏｎ邋ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ邋ｔｏ邋ｐｒｏｄｕｃｅ邋ｔｈｅ邋ｎｅｘｔ邋ｌｅａｆ邋ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ．逡逑４茎尖分生组织分化的分子调控机制逡逑４．１茎尖分生组织分化活动的转录调控逡逑转录水平调控是真核生物基因表达调控的重要环节，可根据周边环境或自身发育需要逡逑过转录因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｆａｃｔｏｒｓ，邋ＴＦｓ）在特定条件下对基因转录活性进行调控，进而影响逡逑尖分生组织的分化活动。转录因子是一群能与基因５＇端上游特异性结合，进而促使目的逡逑因以特定的强度在特定的时间和空间表达的蛋白质分子。有关

陆维超：杨树茎尖小ＲＮＡ组学和种子萌发技术研究第二章材料与方法逡逑材料逡逑材料逡逑料取自扬州大学校园内（３２．３９°邋Ｎ，邋１１９．４２°邋Ｅ）的毛白杨（Ｐｏｐｗ／ｉｗｔｏｗｅｒｔｔｏｒａ２０年，栽培管理一致，生长发育正常，具有代表性。为验证发育周期中不的分子变化，我们采集三个发育阶段的实验材料。恢复活跃期的材料采集尖周围无明显叶片附着；活跃初期的材料采集于当年四月，茎尖周边有数片；活跃稳定期材料采集于当年六月，茎尖周围生长着大量深绿色成熟叶片，样品采集洗净后即迅速使用－８０°Ｃ液氮进行超低温冷却保存用于后续实验。阶段的样品均用于进行组织块包埋和荧光定量实验，同时包含大量生理生期样品提取ＲＮＡ用于高通量测序。逡逑

３．１茎尖分生组织和叶片的形态学和解剖结构观察逡逑毛白杨茎尖分生组织和叶片无论是外部形态还是组织结构上均存在着明显季异。通过数码相机拍摄毛白杨茎尖分生组织和叶片可以发现，在恢复活跃期，茎尖织位于茎干顶端，周边无叶片附着（图５－ａ）。而活跃初期和稳定活跃期，茎尖分周边有叶片生成，叶片位于茎尖下端，卵形或三角状卵形，上表皮暗绿色有金属光表皮光滑，具深波状齿牙缘，接近茎尖的叶片更为幼嫩。且活跃稳定期相对于活跃叶片，叶色更深，体积更大，更为成熟（图５－ｂ，ｃ）。进一步对不同时期茎尖分生叶片进行组织块包埋处理，并采用树脂切片技术，光学显微镜下观察两者在细胞水差异。恢复活跃期的茎尖分生组织中的并无明显干细胞群的出现（图５－ｄ）。而在期的茎尖分生组织中则可发现明显的原体－原套模型，顶部有数层细胞明显呈带状胞体积较小，排布紧密。远离顶部的细胞，细胞体积较大，且无带状排列现象出现，现象在前人的研宄中表明与干细胞群的形成有关［９７］。这些现象在活跃稳定期并无现，且叶片已可从表皮层分化出来（图５－ｅ，ｆ）。此外，活跃稳定期相对于活跃初叶片排列更为紧密，细胞层数更多（图５－ｇ，ｈ）。逡逑

本文编号：2818603