不同树龄银杏叶片差异蛋白研究

发布时间：2020-09-27 18:11

　　银杏(Ginkgo biloba L.)是我国独有的孑遗树种。其树姿优美、寿命长、抗病虫、适应性强、观赏价值高,在我国分布极广,是重要的园林绿化树种,在许多地区均有树龄超过千年的古银杏。这些生长千年的银杏也被誉为“国之瑰宝、绿色文物”。目前对古银杏的研究还较为滞后,许多科学问题亟待解决,如银杏生长千年而不衰的分子机制,古银杏出现衰退迹象的影响机制依然未知。本研究在建立银杏叶片蛋白提取及双向凝胶电泳体系的基础上,对银杏随着树龄增长其生理学指标及蛋白表达的差异特征进行探讨,为进一步深入分析和挖掘银杏抗衰老过程中的差异蛋白表达及参与的代谢途径提供了参考。主要结果如下:通过比较TCA/丙酮沉淀、Tris-HCl缓冲液提取和SDS-苯酚三种提取方法的原理、蛋白质产量和质量、双向凝胶电泳图谱(蛋白点数量及分辨度),我们发现:TCA/丙酮法蛋白沉淀量很多,但其溶解程度差、双向电泳图谱中蛋白点较少;Tris-HCl提取法与SDS-苯酚蛋白沉淀量及蛋白溶解程度差异不大,但Tris-HCl法所制备的样品在2-DE图谱中蛋白点较少,SDS-苯酚法所提取的蛋白质在2-DE图谱的水平和垂直方向均产生最清晰的蛋白点。故而,以SDS-苯酚提取法最佳。对黄柏塬20年、600年和1200年的银杏叶片的生理进行测定,结果显示,不同树龄银杏叶片的生理活性存在明显差异:相对于20年和600年生银杏,1200年生的古银杏叶组织中叶绿素、可溶性蛋白含量显著下降,MDA含量显著升高,SOD和POD活性下降,表明随着树龄的增长,银杏古树在叶片生理指标方面出现衰老症状。对楼观台和黄柏塬不同树龄银杏叶片蛋白质的双向电泳及图谱分析结果显示:银杏叶片中的蛋白分子质量大多分布在20~50kDa之间,而蛋白的等电点主要集中分布在pH5~pH 6.5;从蛋白点的三维峰图可直观地看出,蛋白点1731、2520的丰度均随着树龄增加而升高,而蛋白点3312的丰度随着树龄增加而减少;在黄柏塬不同树龄银杏叶片的2-DE图谱中共挑出36个显著差异蛋白点,通过聚类分析可将其归为四个大类,Ⅰ组中包含的4个蛋白点在20年生银杏中未检测到,但在600年及1200年生银杏叶片中表达量很高;Ⅱ组中包含的12个蛋白质均上调表达,但在600年和1200年生银杏叶片中表达量差异不大;Ⅲ组中涉及到11个蛋白质均随着年龄增大呈下调表达;Ⅳ组中包含的9个蛋白质,在1200年生银杏中表达量最高。对楼观台银杏叶中获取的差异蛋白点进行MALDI TOF/TOF MS/MS分析,共鉴定出30种差异蛋白质。根据http://www.uniprot.org/查询的这些蛋白质功能注释,将其划分为8个功能组,包括能量和碳水化合物代谢、光合作用、胁迫响应、蛋白质氨基酸代谢、次生代谢、脂质代谢、转录起始因子等功能组。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S792.95
【部分图文】：

技术路线图

提取银,蛋白质,凝胶,图谱

图 2-1 三种提取银杏叶片蛋白质方法的凝胶图谱（a-SDS-苯酚提取法；b- Tris-HCl 提取法；c-TCA/丙酮提取法）Fig. 2-1 The 2-DE profiles of proteins extracted by three methods2.3 讨论2.3.1 蛋白质浓度及含量双向电泳中最重要的是样品制备。生物样品种类繁多，没有标准的样品的制备方但是还是能够找到几个基本的原则来指导双向凝胶电泳的样品制备，其中最关键的是品的浓度，任何生物样品的制备，都无一例外要确定样品溶液的浓度。一般，最理想样品浓度是在 5~10μg/μL（靖长柏 2011），这个浓度时，考马斯亮蓝染色的上样量 60的体积为 60~120μL。利用 Bradford 法测定比较三种提取方法所获得的叶片蛋白质的量，最终可溶性蛋白质含量并没有统计学差异。然而，当使用其他物种如软橡木的叶织时，SDS-苯酚提取法（2.35mg/g 鲜重）比 TCA-丙酮得到更高的蛋白质产量（0.46m鲜重）。TCA-丙酮与苯酚相比，在缓冲液中会存在有大量的难溶解的沉淀物，我们最回收的蛋白质值在文献报道的范围内（Carpentier et al. 2005）。Yeoh（Yeoh et al. 199等人在研究 90 株植物中的蛋白质含量时发现，拟南芥的含量比菠菜低 6 倍。此外，

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图 3-1 不同树龄银杏叶组织生理指标（T1，T2 和 T3 分别代表 20±5，600±50 和 1200±100 年生银杏）Fig. 3-1 The physiological indexes of Gingko leaves at different agesLeshem（1981）指出，叶片衰老最明显的表现就是叶绿素逐渐消失，并伴随以及叶片的最终脱落（李丽 2009）。许多研究表明，叶绿素含量和植物衰老之间显的负相关（陈靠山等 1991; 戴金平等 1991），即衰老程度越严重，叶绿素含量如图 3-1A 所示，叶绿素含量在 T1（幼龄）和 T2（中龄）间变化不显著，然而在显著降低，分别比 T1 和 T2 减少了 28.8%和 35.1%。如图 3-1 B 为可溶性蛋白质

【参考文献】