巴西橡胶树遗传图谱第6、16号连锁群上16个标记的物理定位分析

发布时间：2020-11-07 13:31

　　 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)属于大戟科橡胶树属,是一种多年生热带乔木。天然橡胶的主要来源是从橡胶树中产生的胶乳,具有十分重要的商业利用价值。前人已先后利用不同的分子标记技术构建了巴西橡胶树的多张遗传图谱,但是遗传图谱与染色体之间的关系尚不明确。将物理图谱和遗传图谱整合,构建分子细胞遗传学图谱,对于基因组序列的正确组装,序列拼接具有重要意义。本研究以巴西橡胶树热研7-33-97品种为材料,利用荧光原位杂交与原位PCR技术,选取Lespinasse等构建的橡胶树遗传图谱第6号和第16号连锁群上的16个RFLP标记,将这些标记定位到巴西橡胶树的染色体上,通过核型分析,从而确定这些标记在染色体的位置,以及连锁群和染色体的对应关系。研究结果如下:(1)来自第6号连锁群上的13个遗传标记被定位到了巴西橡胶树热研7-33-97的第3号染色体上,遗传图谱中连锁群上遗传标记排列顺序和在染色体上的位置顺序是一致的。其中 gHbCIR477、gHbCIR689.L1、gHbCIR140、gHbCIR207、gHbCIR 121、gHbCIR523.L1、gHbCIR150、gHbCIR 528这8个遗传标记在3号染色体的短臂上,信号位点到着丝粒的百分距离依次为56.55、37.59、33.16、28.78、21.51、17.79、15.67和 4.63,而 gHbCIR475、gHbCIR129/489、gHbCIR647.L1、gHbCIR396、gHbCIR675这5个遗传标记在3号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离依次为28.02、30.96、51.04、53.69、66.34,着丝粒的位置在遗传标记gHbCIR528与遗传标记gHbCIR475 之间。(2)来自第16号连锁群上的6个遗传标记(gHbCIR421、gHbCIR588、gHbCIR647.L2、gHbCIR130、gHbCIR523.L2 和 gHbCIR689.L2)被定位到了巴西橡胶树热研7-33-97的第15号染色体上,并且遗传图谱中连锁群上遗传标记排列顺序和在染色体上的位置顺序是一致的。其中gHbCIR421、gHbCIR588、gHbCIR647.L2和gHbCIR130标记在15号染色体的短臂上,信号位点到着丝粒的百分距离依次为27.96、18.98、15.40 和 12.56,而 gHbCIR523.L2 和 gHbCIR689.L2 遗传标记在 15 号染色体的长臂上,信号位点到着丝粒的百分距为43.13和60.50,着丝粒的位置在遗传标记gHbCIR130与遗传标记gHbCIR523.L2之间。(3)通过第6号和第16号连锁群的定位结果,我们可以初步判定:Lespinasse等构建的遗传图谱上第6号连锁群与巴西橡胶树热研7-33-97的第3号染色体对应;第16号连锁群与巴西橡胶树热研7-33-97的第15号染色体对应。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S794.1
【部分图文】：

按照前述ＤＮＡ全基因组的提取方法，总共进行了?４个重复巴西橡胶树７－３３－９７??基因组?ＤＮＡ?的提取，以？ｉ－Ｈｉｎｄｌｌｌ?ｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ）为参照、以?５叫与?２ｐＬ６ｘｌｏａｄｉｎｇ??ｂｕｆｆｅｒ混合进行凝胶电泳检测，图１中条带单一清晰、无明显拖尾与降解且分子量均??大于２３．１３ｋｂ说明提取的基因组ＤＮＡ完整。再进一步将提取的ＤＮＡ用紫外分光光度??计进行检测，得到的浓度均为２００－４００ｎｇ／ｐＬ，?ＯＤ２６０／２８０的值均在１．６－１．８之间，说??明提取的ＤＮＡ浓度和纯度都符合实验所需要求。??１３０ｂｐ—??■??图１热研７－３３－９７品种叶片基因组ＤＮＡ的１０个重复图??Ｆｉｇ．ｌ?Ｔｅｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ｏｆ?Ｌｅａｖｅｓ?ｏｆ?７－３３－９７??３．２?１６个遗传标记特异性序列扩增与序列比对结果??将设计的引物通过以提取的基因组ＤＮＡ为模板并按照ＰＣＲ反应体系与条件（参照??２．２．３．２）进行ＰＣＲ扩增，经扩增产物凝胶电泳检测，检测结果如图２，目的产物为单一??条带，且大小与设计引物时扩增目标片段一致。将扩增出的ＰＣＲ产物进行胶回收和试剂??盒纯化，为了进一步验证扩增的ＤＮＡ片段为我们所要的目的片段，将回收得到产物送由??上海英俊公司进行测序。将测序后的序列进行拼接，将拼接的序列与我们目的序列在??ＮＣＢＩ进行Ｂｌａｓｔ比对，比对结果见表５和附图１－１６。，通过表５，扩增得到的ＰＣＲ与目??的序列的相似都均在９０％以上，比对结果吻合，说明扩增出的ＤＮＡ片段就是我们所要??的目的片段

Ｆｉｇ．２?Ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｗｅｒｅ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｐｒｏｄｕｃｔｓ?ａｔ?Ｒｅｙａｎ?３－３３－９７??（图中閱，１－１６分别对应２００卜卩０１＼八１３（１（１６犷１＼１３１＾１＊（丁３１＾＾）、邑《＾（：１１＾４７７、廷１１１）＜：１１１１ｂＣＩＲ２０７、ｇＨｂＣＩＲ１２１、ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌ２?．?ｇＨｂＣＩＲ１５０、ｇＨｂＣＩＲ５２８ｂＣＩＲ４７５、ｇＨｂＣＩＲ１２９／４８９、ｇＨｂＣｌＲ３９６、ｇＨｂＣＩＲ６７５、ｇＨｂＣＩＲ６４７．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ６４７．ＬｂＣＩＲ６８９．Ｌｌ／ｇＨｂＣＩＲ６８９．Ｌ２、ｇＨｂＣＩＲ５８８、ｇＨｂＣＩＲ４２１、ｇＨｂＣＩＲ１３０）??（Ｉｎ?ｔｈｅ?ｆｉｇｕｒｅ，Ｍ，?１－１６?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ?２００ｂｐ?ＤＮＡ?ｌａｄｄｅｒ?Ｍａｋｅｒ?（Ｔａｋａｒａ）、ｇＨｂＣＩＲ４７ｂＣＩＲ１４０、ｇＨｂＣＩＲ２０７、ｇＨｂＣＩＲ１２１、ｇＨｂＣＩＲ５２３丄?１／?ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌ２、ｇＨｂＣＩＲ１５０ｂＣＩＲ５２８、ｇＨｂＣＩＲ４７５、ｇＨｂＣＩＲｌ２９／４８９、ｇＨｂＣＩＲ３９６、ｇＨｂＣＩＲ６７５、ｇＨｂＣＩＲ６４７ｂＣＩＲ６４７．Ｌ２、?ｇＨｂＣＩＲ６８９．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ６８９丄?２、?ｇＨｂＣＩＲ５８８、?ｇＨｂＣＩＲ４２１ｂＣＩＲ１３０ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）??表６测序序列与目的序列比对结果??Ｔａｂｌｅ?６?Ｃｏｍｐａｒｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ａｎｄ?ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ?ｓ

３．３．１?ｇＨｂＣＩＲ４７７遗传标记的物理定位??用ｇＨｂＣＩＲ４７７的特异ＤＮＡ序列标记为ＤＩＧ标记的探针进行ＦＩＳＨ检测分析，得??到如图３的结果，通过图３可知在染色体分裂的不同时期均能检测到２个信号位点，??根据Ｓｏｎｇ?Ｙ等１９９５年报道的信号位点的百分距离的计算方法，结合高和琼等（２００９）??的核型分析数据进行核型结合分析，得到图３－Ａ５的核型图。ｇＨｂＣＩＲ４４７遗传标记位??于第３号染色体的短臂上，信号位点到着丝粒的百分距离为５６．５５：???ＨＵ??图３?ＤＩＧ标记的ｇＨｂＣＩＲ４７７遗传标记在巴西橡胶树热研７－３３－９７有丝分裂各个时期的镜检??图（Ａ１：间期；Ａ２：前期；Ａ３：中期；Ａ４：阴性对照；Ａ５：中期细胞核型图）??Ｆｉｇ．３?Ｇｅｎｅｔｉｃ?ｍａｒｋｅｒｓ?ｏｆ?ｇＨｂＣＩＲ４７７?ｍａｒｋｅｄ?ｂｙ?ＤＩＧ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ?ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｖａｒｉｏｕｓ??ｐｅｒｉｏｄｓ?ｏｆ?ｍｉｔｏｓｉｓ?ｏｆ?Ｒｅｙａｎ?７－３３－９７?ｏｆ?Ｈｅｖｅａ?ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ?（Ａｌ：Ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；?Ａ２：Ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；??Ａ３：Ｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；Ａ４：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ；?Ａ５：?ｋａｒｙｏｔｙｐｅ?ｏｆ?Ｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ）??３．３．２?ｇＨｂＣＩＲ１４０遗传标记的物理定位??用ｇＨｂＣＩＲ１４０的特异ＤＮＡ序列标记为ＤＩＧ标记的探针进行ＦＩＳＨ检测分析，得??到如图４的结果
【参考文献】

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本文编号：2874017