江苏省不同生态区内银杏内生细菌多样性及其与银杏次生代谢产物相关性初步研究

发布时间：2020-11-10 14:12

　　 银杏是一种古老的孑遗木本,是一种常见的药食同源植物,其叶可以产生如黄酮、银杏内酯等具有较好药用效果的次生代谢产物。银杏叶提取物生产的效率和质量与叶中次生代谢产物的含量和种类直接相关。包括叶在内的银杏各组织部位中定殖着种类丰富的内生细菌,这些微生物生活在银杏组织或细胞内,并与银杏一起协同进化,经过长时间的共存后逐渐形成了互惠共生的关系。研究表明,植物内生细菌可以产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物,但银杏内生细菌是否会影响宿主产生次生代谢产物,尚未得到深入的研究。探究银杏内生细菌与银杏不同种类次生代谢产物含量之间的相关性,可以初步探索两者之间存在的潜在关系,为找到能够提高银杏叶有效次生代谢产物含量的细菌提供了前期研究基础。我国的银杏主产区-江苏省,位于中国大陆中东部沿海,气候类型由北往南逐渐从温带向亚热带过渡。本文根据气候等生态因子的差异将江苏省划分为4个生态区,并以生态区内银杏不同部位的组织做为样品,分析不同生态区中银杏内生细菌群落结构多样性。通过提取不同生态区中银杏叶次生代谢产物并对其含量进行测定,分析不同生态区中银杏叶次生代谢产物种类及含量的多样性。以江苏省为单位,运用R语言对银杏内生细菌多样性及叶中次生代谢产物的关系进行相关性分析,初步探究内生细菌多样性与银杏次生代谢产物之间的相互关联。本文的主要研究内容和结果如下:1.采用高通量测序技术,分析了不同组织各样品的内生细菌OTU聚类情况、分类学分析、多样性等指标,对不同生态区中各组织部位的内生细菌多样性及群落结构进行了分析发现:(1)沿海生态区中银杏内生细菌群落多样性最丰富,分布在53个纲中,苏北生态区中银杏内生细菌群落多样性最低分布在31个纲中,苏南生态区和苏中生态区银杏内生细菌多样性较为接近,分别分布在47和42个纲中,群落结构更为相似。(2)银杏根部的内生细菌多样性最丰富,且包含了茎和叶中所有聚类得到的内生细菌;叶部和茎部组织内生菌多样性较为相近,且群落结构更为相似。2.对四个生态区中银杏叶次生代谢产物的种类及含量进行了测定。通过气质连用法(GC-MS)测定弱极性成分,紫外分光光度法测定总黄酮含量,HPLC-ELSD法测定银杏内酯A、银杏内酯B及银杏内酯C等三种银杏内酯的含量,并对银杏叶多糖成分含量及多糖的单糖组成进行了测定。(1)共得到弱极性成分126种,其中苏南生态区共58种,苏中生态区55种,沿海生态区48种,苏北生态区68种。苏北生态区叶中的弱极性成分种类最为丰富,沿海生态区叶中弱极性成分种类最少。(2)秋季银杏叶中总黄酮含量最高的为苏南生态区,其余三个生态区样品的总黄酮含量较为接近,苏北生态区含量略低于沿海和苏中生态区。(3)苏南和苏中生态区银杏叶中银杏内酯A的含量相对较高,苏中、沿海、苏北银杏叶中银杏内酯B的含量较为接近,苏南生态区含量最低;苏北生态区银杏叶中银杏内酯C的含量最高,苏中银杏叶中银杏内酯C的含量最低。(4)秋季银杏叶中多糖含量最高的为苏北生态区,其次是苏南生态区,苏中和沿海生态区银杏叶多糖含量较为接近。3.在发现不同生态区中银杏内生细菌多样性及次生代谢产物之间均存在明显差异的基础上,运用R语言对二者的相关性进行了分析,得出:(1)对次生代谢产物积累的相关性最显著的是分布在Gammaproteobacteria纲中内生细菌,这些内生细菌对银杏叶总黄酮含量、银杏内酯A和银杏内酯B含量都具有显著的相关性,相关性指数分别为0.94、0.76和-0.96。(2)银杏叶中多糖含量的高低与内生细菌相对丰度的高低相关性最广泛,其含量的高低与7个纲的内生细菌相对丰度有显著的相关性,其中相关性最高的为Clostridia,相关性指数为-0.98。
【学位单位】：江苏师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S792.95
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 银杏概述
    1.2 银杏次生代谢产物
        1.2.1 银杏黄酮成分及其生物活性
        1.2.2 银杏内酯及其生物活性
        1.2.3 银杏多糖的单糖组成及其生物活性
    1.3 植物内生菌
        1.3.1 定义
        1.3.2 内生菌次生代谢产物及其活性
    1.4 内生菌多样性研究
        1.4.1 多样性指数
        1.4.2 传统培养法
        1.4.3 免培养法
        1.4.4 高通量测序技术
    1.5 选题背景及研究目的
    1.6 选题创新性简述
2 江苏不同生态区银杏内生细菌多样性
    2.1 试剂和仪器
        2.1.1 主要仪器
        2.1.2 试剂
    2.2 材料及采样地点
    2.3 样品处理
    2.4 方法
        2.4.1 基因组DNA提取
        2.4.2 PCR扩增及检测
        2.4.3 文库构建及测序
    2.5 内生菌生物信息学分析
        2.5.1 数据统计及优化
        2.5.2 OTU聚类
        2.5.3 稀释性曲线
        2.5.4 分类学分析
        2.5.5 多样性指数
        2.5.6 Shannon-Wiener曲线
        2.5.7 Rank-Abundance曲线
        2.5.8 OTU分布VENN图
    2.6 结果与分析
        2.6.1 数据统计结果
        2.6.2 OTU聚类
        2.6.3 稀释性曲线（Rarefaction curve）
        2.6.4 分类学分析结果
        2.6.5 多样性指数（Alpha-diversity）
        2.6.6 Shannon-Wiener曲线
        2.6.7 Rank-Abundance曲线
        2.6.8 OTU分布VENN图
    2.7 本章小结
3 江苏不同生态区银杏叶次生代谢产物
    3.1 材料
    3.2 试剂和仪器
        3.2.1 主要仪器
        3.2.2 主要试剂
    3.3 方法
        3.3.1 银杏叶弱极性成分的测定
        3.3.2 银杏叶黄酮类物质的测定
        3.3.3 银杏叶银杏内酯的测定
        3.3.4 银杏叶多糖成分的测定
    3.4 结果与分析
        3.4.1 银杏叶弱极性成分的测定结果
        3.4.2 银杏叶黄酮类物质的测定结果
        3.4.3 银杏叶银杏内酯的测定结果
        3.4.4 银杏叶多糖成分的测定结果
    3.5 本章小结
4 江苏不同生态区银杏内生细菌多样性与银杏次生代谢产物的相关性
    4.1 方法
    4.2 结果与分析
    4.3 本章小结
5 总结及展望
参考文献
致谢
作者简历
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本文编号：2878024