吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007工程菌构建及其效应研究

发布时间：2020-11-18 23:57

　　 随着我国杨树种植面积的逐年增加,以及在杨树造林过程中林木抚育、管理、保护、防治不当等原因,杨树病虫害的发生日趋严重,同时阻碍了我国林业的生产和发展。我国杨树病虫害的综合治理仍以化学防治为主导,然而化学农药的长期使用不但防治效果变差,而且给自然环境造成一定的污染和残留。因此,利用微生物代替化学农药来防治植物病虫害越来越受林业保护工作者的青睐。植物内生细菌定殖于健康植物体内,与寄主植物在长期进化过程中形成和谐联合关系,并对寄主植物具有抗病、促生、固氮和生物修复等生防潜力,是潜在的天然生物防治资源。此外,内生细菌还可作为外源基因的良好载体,通过基因工程技术将外源抗病、杀虫基因导入内生细菌中,提高植物抗病虫害等能力的同时不改变植物自身的基因组。因此,利用植物有益内生细菌及其工程菌株促进植物生长,并提高植物的抗病虫害能力已成为植物病虫害生物防治的研究热点。课题组前期从杨树干部分离到一株杨树内生细菌吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007,该菌株不仅能促进杨树生长,还对杨树溃疡病具有一定防治效果,是一株安全的杨树溃疡病生防菌株。洋葱伯克氏菌群Burkholderia cepacia complex(Bcc)的许多菌株对多种植物病原真菌具有拮抗作用,并已被广泛应用与植物病害的生物防治,但目前国内外有关Bcc工程菌构建的报道尚不多见。本研究以B.pyrrocinia JK-SH007菌株为研究对象,分别将外源抗病、杀虫基因导入JK-SH007中,构建具有促生、抗病、抗虫多重生防能力的高效生防工程菌。同时,对工程菌株JK-SH007E1在杨树根际产生的微生态效应进行研究,初步评估工程菌株释放到环境后的生物安全性。根据同源重组原理,分别将枯草芽孢杆菌的几丁质酶基因Chi113、苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因cry218、苏云金芽孢杆菌的营养期杀虫蛋白基因vip3A和松材线虫的几丁质酶基因Bxchi插入到pHKT2载体上的启动子与gfp报告基因之间,成功构建了四个重组质粒pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A和pHKT2-Bxchi。质粒遗传稳定性试验表明,除重组质粒pHKT2-Bxchi外,其余三个重组质粒均有较高的遗传稳定性,其中重组质粒pHKT2-Chi113的遗传稳定性最高。利用热激法将pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A和pHKT2-Bxchi四个重组质粒分别转化JK-SH007感受态细胞,获得了四株工程菌JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3和JK-SH007E4。这四株工程菌在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光信号,并且四个外源基因在mRNA水平均得到过表达,而在蛋白水平只有工程菌JK-SH007E1检测到外源基因的表达。与野生型菌株JK-SH007相比,工程菌JK-SH007E1产生的几丁质酶活性及其对杨树溃疡病菌的抑菌活性和拮抗能力均得到显著提高。通过对工程菌JK-SH007E1在杨树体内的定殖规律研究,发现工程菌JK-SH007E1能够以较快的速度进入杨树体内,并能在杨树体内长期稳定地定殖。GFP标记法观察工程菌JK-SH007E1在杨树无菌苗体内的定殖,发现JK-SH007E1在杨树组织细胞内和细胞间隙均有分布。此外,工程菌JK-SH007E1的引入明显增强了杨树的光合作用能力和加快了杨树的生长速度。对工程菌JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3和JK-SH007E4的生长特性进行研究,并与野生菌JK-SH007进行比较,结果表明外源基因的导入并未影响原有的菌落特征及细胞形态,但外源重组质粒的导入在一定程度上减缓了宿主菌的生长速度。作为转基因微生物,工程菌JK-SH007E1释放到自然环境中前,必须对其生物安全性进行充分评估。本研究同时利用生物化学法、Biolog生态板法和16S rRNA高通量测序技术,充分评估工程菌JK-SH007E1的引入对杨树根际土壤产生的微生态效应。通过测定杨树根际四种主要土壤酶活性,发现工程菌JK-SH007E1的引入增强了杨树根际的土壤酶活性,尤其是对土壤脱氢酶活性的促进作用尤为显著;同时提高了土壤的肥力,从而促进杨树生长。Biolog生态板分析结果表明,工程菌JK-SH007E1在一定程度上提高了杨树根际土壤微生物的整体活性,丰富了土壤微生物种群及其功能多样性,但随着接种时间的延长促进作用逐渐减弱。16S rRNA高通量测序结果表明工程菌JK-SH007E1的引入会引起杨树根际微生物群落结构发生变化,但该影响会随接种时间的延长而变弱。以上研究结果均表明,从长期来看工程菌JK-SH007E1的应用对杨树根际微生物多样性和种群结构不构成潜在威胁或威胁较小。因此,将工程菌JK-SH007E1释放到环境中是安全可行的。该研究为杨树溃疡病生物防治提供了高效生防菌株,并为今后工程菌JK-SH007E1的安全应用奠定了理论基础。
【学位单位】：南京林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S763.7
【部分图文】：

图 2-1 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测（a，M：500 bp ladder DNAmaker（由上到下依次为 5000 bp、4500 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp、500 bp）；泳道 1，2，3，4 分别为含 Chi113、cry218、vip3A、Bxchi基因的大肠杆菌阳性克隆；b，M：1000 bp ladder DNAmaker（由上到下依次为 10000 bp、9000 bp、8000bp、7000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3000 bp、2000 bp、1000 bp）；泳道 1，2，3，4 分别为含 Chi113、cry218、vip3A、Bxchi 的重组质粒的 HindⅢ和 KpnⅠ双酶切验证；c，M：500 bp ladder DNA maker；泳道 1，2，3，4 分别为含 Chi113、cry218、vip3A、Bxchi 的 JK-SH007 转化子的外源基因检测）Fig. 2-1 Agarose gel electrophoresis detection of PCR amplified products(a, M: 500 bp ladder DNA maker (molecular weight of each band from up to down was as follows: 5000 bp,4500 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 500 bp); Lane 1, 2, 3, 4 werepositive clones that with Chi113、cry218、vip3A、Bxchi respectively. b, M: 1000 bp ladder DNA maker(molecular weight of each band from up to down was as follows: 10000 bp, 9000 bp, 8000 bp, 7000 bp, 6000bp, 5000 bp, 4000 bp, 3000 bp, 2000 bp, 1000 bp); Lane 1, 2, 3, 4 were Hind III and Kpn I double digestion ofrecombinant plasmids that with Chi113、cry218、vip3A、Bxchi respectively. c, M: 500 bp ladder DNA maker;Lane 1, 2, 3, 4 were the foreign genes detection of JK-SH007 transformants that with Chi113、cry218、vip3A、Bxchi respectively)

33图 2-2 pHKT2 质粒（a）及四个重组质粒（b，c，d，e）的图谱（用软件 WinPlas version 2.7 绘制）Fig. 2-2 Maps of plasmid pHKT2 (a) and the four recombinant plasmids (b, c, d, e)(Drawn by WinPlas version 2.7)

2.2 重组质粒转化 B. pyrrocinia JK-SH007 感受态细胞及阳性克隆的筛选2.2.1 JK-SH007 转化子的荧光观察利用热激转化法将上述构建的四个重组质粒分别转化 JK-SH007 感受态细胞，在 Tp 抗性平板上对阳性转化子进行筛选。JK-SH007 菌株在荧光显微镜下是没有绿色荧光背景的而pHKT2载体上含有gfp基因，含有该质粒的转化子在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光因此可根据转化子的绿色荧光发生情况对 JK-SH007 阳性转化子进行初步筛选。从转化平板上随机挑取单菌落，制成玻片后在 Zeiss 荧光显微镜下观察，将发绿色荧光的 JK-SH00转化子初步作为阳性克隆。如图 2-3 所示，在荧光显微镜下 JK-SH007 细胞观察不到绿色荧光信号，而含有外源重组质粒的工程菌 JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3 和JK-SH007E4 均能观察到明亮的绿色荧光信号，初步证明重组质粒 pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A 和 pHKT2-Bxchi 已成功导入 JK-SH007 中。
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本文编号：2889392