丹参转录因子SmbHLH74调控丹参酮生物合成的分子机制
发布时间：2020-03-31 07:24
【摘要】：丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国传统药材,在预防和治疗心脑血管疾病等方面疗效显著使得丹参药材紧缺,市场上供不应求。丹参的药效成分主要是丹参酮类和丹酚酸类化合物,解析其活性成分的代谢调控网络,对提升丹参药材品质具有重要的理论指导意义。转录因子在调控植物次生代谢方面扮演着重要角色,本研究以丹参为试验材料,重点分析了一个在根部高丰度表达的转录因子SmbHLH74调控丹参酮生物合成的功能,丹参毛状根中过量表达SmbHLH74可以显著抑制丹参酮的积累,利用凝胶迁移阻滞、染色质免疫共沉淀以及双荧光素酶报告基因检测等试验,解析了转录因子SmbHLH74抑制丹参酮生物合成的分子机制;另外发现SmMYC2是SmbHLH74的直接上游调控分子,进而探讨了JA通过SmMYC2削弱SmbHLH74抑制丹参酮积累的分子机制。主要结果如下:1.从丹参中克隆了SmbHLH74基因,CDS为696 bp,编码231个氨基酸。2.SmbHLH74在根中高水平表达,茎和叶片中的表达水平很低;外源MeJA处理可以显著抑制SmbHLH74的转录。3.通过遗传转化获得过表达SmbHLH74的丹参转基因毛状根,在SmbHLH74-OE4、SmbHLH74-OE12和SmbHLH74-OE19过表达毛状根株系中隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量显著降低;利用RT-qPCR分析了转基因材料中丹参酮生物合成途径基因的表达水平,SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的表达量呈显著下调,推测这三个基因可能是SmbHLH74的直接靶基因。4.为解析SmbHLH74抑制丹参酮积累的分子机制,利用ChIP-qPCR和EMSA试验证实了SmbHLH74转录因子在丹参体内和体外直接结合SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的启动子;进一步双荧光素酶报告基因检测试验表明SmbHLH74直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1启动子的转录活性。5.JA显著抑制SmbHLH74的转录,推测JA信号关键转录因子SmMYC2可能是SmbHLH74的上游分子,通过Y1H和EMSA试验发现SmMYC2可以结合SmbHLH74的启动子;GUS报告试验表明SmMYC2直接负调控SmbHLH74的转录,说明SmMYC2直接介导了JA对SmbHLH74的转录抑制。综上,本研究揭示了SmbHLH74直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的转录从而负调控丹参酮生物合成,而JA通过SmMYC2直接抑制SmbHLH74的转录,削弱了SmbHLH74对丹参酮积累的抑制。
【图文】：
沈阳农业大学硕士学位论文ang et al., 2012a；蔡媛 等, 2013)。前，丹参酮生物合成途径的解析基本完成，已经有不少关键酶基因被成功克了功能验证(宋经元 等, 2013；Ma et al., 2015)，包括 SmHMGR1、SmDXS、SmHPS、SmCPS、SmKSL 和 SmCYP76AH1 等。其中 Kai et al.利用基因工程手段表达 SmHMGR1 和 SmGGPPS，发现转基因毛状根中丹参酮含量显著升高， 4.74 倍(Kai et al., 2011)。Hao et al.发现 SmHDR1 促进丹参毛状根中丹参酮的 et al., 2013)。Zhou et al.研究表明，SmCPS 和 SmKSL 是丹参酮合成途径中的因(Zhou et al., 2012)。Guo et al.利用酵母系统，证明 SmCYP76AH1 能有效催酮二烯生成铁锈醇，产量高达 10.5 mg/L(Guo et al., 2013；蔡媛 等, 2013)。由以丹参酮生物合成途径中的酶基因为靶点，利用基因工程手段可以有效提高含量(Nims et al., 2006)。
图 2 凝胶电泳检测 PCR 产物Fig.2 The PCR products detection by agarose gel electrophoresis蛋白结构分析，该基因编码 231 个氨基酸，NCBI 分析如图 3 所示，，SmbHLH74转录因子有保守的 HLH 结构域，有特定的 E-box/N-box 结合位点，属于 bHLH 家族转录因子。SOPMA 预测，该转录因子定位于细胞核。如图 4 所示把 SmbHLH74 与拟南芥的 bHLH 转录因子构建系统进化树，发现 SmbHLH74 与 AtbHLH75 的同源性最高。ExPASy 分析如图 5 所示，SmbHLH74 蛋白的分子量约为 26.3 KD，理论 pI 为 5.84，为亲水性蛋白。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.53
【图文】：
沈阳农业大学硕士学位论文ang et al., 2012a；蔡媛 等, 2013)。前，丹参酮生物合成途径的解析基本完成，已经有不少关键酶基因被成功克了功能验证(宋经元 等, 2013；Ma et al., 2015)，包括 SmHMGR1、SmDXS、SmHPS、SmCPS、SmKSL 和 SmCYP76AH1 等。其中 Kai et al.利用基因工程手段表达 SmHMGR1 和 SmGGPPS，发现转基因毛状根中丹参酮含量显著升高， 4.74 倍(Kai et al., 2011)。Hao et al.发现 SmHDR1 促进丹参毛状根中丹参酮的 et al., 2013)。Zhou et al.研究表明，SmCPS 和 SmKSL 是丹参酮合成途径中的因(Zhou et al., 2012)。Guo et al.利用酵母系统，证明 SmCYP76AH1 能有效催酮二烯生成铁锈醇，产量高达 10.5 mg/L(Guo et al., 2013；蔡媛 等, 2013)。由以丹参酮生物合成途径中的酶基因为靶点，利用基因工程手段可以有效提高含量(Nims et al., 2006)。
图 2 凝胶电泳检测 PCR 产物Fig.2 The PCR products detection by agarose gel electrophoresis蛋白结构分析，该基因编码 231 个氨基酸，NCBI 分析如图 3 所示，，SmbHLH74转录因子有保守的 HLH 结构域，有特定的 E-box/N-box 结合位点，属于 bHLH 家族转录因子。SOPMA 预测，该转录因子定位于细胞核。如图 4 所示把 SmbHLH74 与拟南芥的 bHLH 转录因子构建系统进化树，发现 SmbHLH74 与 AtbHLH75 的同源性最高。ExPASy 分析如图 5 所示，SmbHLH74 蛋白的分子量约为 26.3 KD，理论 pI 为 5.84，为亲水性蛋白。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.53
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3 李s
本文编号：2608760
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