大团囊虫草中balanol合成机制解析
发布时间：2023-11-23 20:04
真菌是微生物源天然药物的重要产生菌,许多真菌的全基因组测序表明其内蕴含大量次级代谢产物的基因簇。在通常的实验室条件下,许多真菌基因簇处于沉默状态,如何激活这些沉默的基因簇是药用基因资源开发的主要研究领域,也是全球新药开发的战略高地。大团囊虫草(Tolypocladium ophioglossoides)是我国传统稀贵的药用真菌,民间用于治疗血崩、月经不调等症。1977年,有研究者在大团囊虫草中发现化合物ophiocordin,并确定其结构与1993年在真菌Vebticiaaium lanoiides中发现的balanol相同。Balanol具有很强的蛋白激酶PKC抑制剂活性和一定的抗真菌活性,且包含一个独特的七元氮杂环结构,其化学全合成路径也已被解析与实施。迄今,balanol的生物合成机制未被揭示。本课题组从西双版纳分离到一株大团囊虫草菌,经过全基因组测序分析,表明其内包含35个生物合成基因簇,其中13个为PKS类型合成基因簇、8个为NRPS类型合成基因簇、6个为PKS-NRPS混合型基因簇、4个萜类化合物基因簇和4个其他类型的基因簇,对大团囊虫草的发酵产物谱分析显示其中大部分生物合...
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 大团囊虫草的开发研究进展
1.1.1 虫草的医药价值
1.1.2 虫草的主要活性成分
1.1.3 大团囊虫草的分类学地位和形态特征
1.1.4 大团囊虫草的分子生物学研究进展
1.2 微生物隐性基因簇激活及研究进展
1.2.1 天然产物研究对新药开发的意义
1.2.2 常用的微生物隐性基因簇激活手段及应用
1.3 Balanol及相关化合物的活性研究
1.3.1 Balanol的发现
1.3.2 Balanol的化学全合成及其类似物的活性研究
1.4 非核糖体肽和聚酮化合物的生物合成
1.4.1 NRPS的组成单元和反应过程
1.4.2 PKS的组成单元和反应过程
1.4.3 对balanol生物合成的推测
第2章 大团囊虫草菌全基因组测序分析及遗传转化体系的构建
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要仪器设备
2.2.2 菌种及质粒
2.2.3 培养基与溶液
2.3 实验方法
2.3.1 大团囊虫草菌的培养
2.3.2 基因组提取
2.3.3 基因组测序及注释
2.3.4 基因组次级代谢产物合成簇分析预测
2.3.5 大团囊虫草菌的抗性标签筛选
2.3.6 大肠杆菌感受态制备
2.3.7 质粒构建
2.3.8 农杆菌感受态制备
2.3.9 农杆菌电转化
2.3.10 农杆菌介导的大团囊虫草菌T-DNA插入转化
2.4 实验结果
2.4.1 基因组组装
2.4.2 基因预测与蛋白质功能注释
2.4.3 次级代谢产物合成簇预测
2.4.4 农杆菌介导转化大团囊虫草菌体系的构建
2.5 小结与讨论
第3章 Balanol隐性基因簇的激活及化合物的分离鉴定
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要仪器设备
3.2.2 菌种及质粒
3.2.3 培养基与溶液
3.3 实验方法
3.3.1 过表达blnR质粒的构建
3.3.2 blnR过表达株的构建
3.3.3 过表达株的发酵及发酵液HPLC分析
3.3.4 RNA样品提取
3.3.5 过表达株簇内基因RT-PCR
3.3.6 化合物分离纯化工艺
3.3.7 质谱和核磁分析
3.4 实验结果
3.4.1 隐性基因簇bln的生物信息学分析
3.4.2 blnR过表达菌株的鉴定
3.4.3 blnR过表达菌株的形态变化
3.4.4 blnR过表达菌株检测产物谱的变化
3.4.5 基因簇RT-PCR检测bln基因簇各基因表达变化
3.4.6 过表达株的发酵液的萃取及化合物分离纯化
3.4.7 化合物结构解析
3.5 小结与讨论
第4章 Balanol生物合成途径的解析
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 主要仪器设备
4.2.2 菌种及质粒
4.2.3 培养基与溶液
4.3 实验方法
4.3.1 qRT-PCR确定bln基因簇的边界
4.3.2 bln基因簇中部分基因的敲除
4.3.3 敲除株代谢产物谱的LC-MS检测
4.3.4 酿酒酵母的LiAc转化
4.3.5 蛋白在酿酒酵母中的异源表达与喂养反应
4.3.6 蛋白在大肠杆菌中的表达纯化与体外反应
4.3.7 同位素标记的底物喂养实验
4.4 实验结果
4.4.1 bln基因簇边界确定
4.4.2 bln基因簇各基因功能注释及分析
4.4.3 bln基因簇中相关合成基因的敲除
4.4.4 bln基因簇相关合成基因敲除株的产物谱检测
4.4.5 blnJ在酿酒酵母中的异源表达和喂养反应
4.4.6 blnJ在大肠杆菌中的表达及体外反应
4.4.7 blnF在大肠杆菌中的表达及体外反应
4.4.8 同位素标记的底物喂养实验
4.4.9 推测的balanol生物合成途径
4.5 小结与讨论
第5章 本论文研究成果及展望
参考文献
附录
攻读博士期间主要研究成果
致谢
本文编号：3866111
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 大团囊虫草的开发研究进展
1.1.1 虫草的医药价值
1.1.2 虫草的主要活性成分
1.1.3 大团囊虫草的分类学地位和形态特征
1.1.4 大团囊虫草的分子生物学研究进展
1.2 微生物隐性基因簇激活及研究进展
1.2.1 天然产物研究对新药开发的意义
1.2.2 常用的微生物隐性基因簇激活手段及应用
1.3 Balanol及相关化合物的活性研究
1.3.1 Balanol的发现
1.3.2 Balanol的化学全合成及其类似物的活性研究
1.4 非核糖体肽和聚酮化合物的生物合成
1.4.1 NRPS的组成单元和反应过程
1.4.2 PKS的组成单元和反应过程
1.4.3 对balanol生物合成的推测
第2章 大团囊虫草菌全基因组测序分析及遗传转化体系的构建
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要仪器设备
2.2.2 菌种及质粒
2.2.3 培养基与溶液
2.3 实验方法
2.3.1 大团囊虫草菌的培养
2.3.2 基因组提取
2.3.3 基因组测序及注释
2.3.4 基因组次级代谢产物合成簇分析预测
2.3.5 大团囊虫草菌的抗性标签筛选
2.3.6 大肠杆菌感受态制备
2.3.7 质粒构建
2.3.8 农杆菌感受态制备
2.3.9 农杆菌电转化
2.3.10 农杆菌介导的大团囊虫草菌T-DNA插入转化
2.4 实验结果
2.4.1 基因组组装
2.4.2 基因预测与蛋白质功能注释
2.4.3 次级代谢产物合成簇预测
2.4.4 农杆菌介导转化大团囊虫草菌体系的构建
2.5 小结与讨论
第3章 Balanol隐性基因簇的激活及化合物的分离鉴定
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要仪器设备
3.2.2 菌种及质粒
3.2.3 培养基与溶液
3.3 实验方法
3.3.1 过表达blnR质粒的构建
3.3.2 blnR过表达株的构建
3.3.3 过表达株的发酵及发酵液HPLC分析
3.3.4 RNA样品提取
3.3.5 过表达株簇内基因RT-PCR
3.3.6 化合物分离纯化工艺
3.3.7 质谱和核磁分析
3.4 实验结果
3.4.1 隐性基因簇bln的生物信息学分析
3.4.2 blnR过表达菌株的鉴定
3.4.3 blnR过表达菌株的形态变化
3.4.4 blnR过表达菌株检测产物谱的变化
3.4.5 基因簇RT-PCR检测bln基因簇各基因表达变化
3.4.6 过表达株的发酵液的萃取及化合物分离纯化
3.4.7 化合物结构解析
3.5 小结与讨论
第4章 Balanol生物合成途径的解析
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 主要仪器设备
4.2.2 菌种及质粒
4.2.3 培养基与溶液
4.3 实验方法
4.3.1 qRT-PCR确定bln基因簇的边界
4.3.2 bln基因簇中部分基因的敲除
4.3.3 敲除株代谢产物谱的LC-MS检测
4.3.4 酿酒酵母的LiAc转化
4.3.5 蛋白在酿酒酵母中的异源表达与喂养反应
4.3.6 蛋白在大肠杆菌中的表达纯化与体外反应
4.3.7 同位素标记的底物喂养实验
4.4 实验结果
4.4.1 bln基因簇边界确定
4.4.2 bln基因簇各基因功能注释及分析
4.4.3 bln基因簇中相关合成基因的敲除
4.4.4 bln基因簇相关合成基因敲除株的产物谱检测
4.4.5 blnJ在酿酒酵母中的异源表达和喂养反应
4.4.6 blnJ在大肠杆菌中的表达及体外反应
4.4.7 blnF在大肠杆菌中的表达及体外反应
4.4.8 同位素标记的底物喂养实验
4.4.9 推测的balanol生物合成途径
4.5 小结与讨论
第5章 本论文研究成果及展望
参考文献
附录
攻读博士期间主要研究成果
致谢
本文编号：3866111
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