水稻B-bZIP转录因子亚家族成员OsbZIP81和OsbZIP84的功能分析

发布时间：2024-01-23 12:05

　　水稻(Oryza sativa L)是世界上最主要的粮食作物之一,也是单子叶植物和谷类作物研究的模式生物。以农杆菌介导的植物遗传转化技术在水稻中的应用也有了长足的发展,为水稻的研究和遗传改良提供了一个坚实的技术基础,但是在转化过程中,由于水稻品种或插入片段大小的不同,转化效率也不尽相同,而部分水稻品种和大片段转化受到了极大的影响;此外,少数bZIP转录因子家族B亚家族成员被报道参与了植物的生长发育和抗病抗冷等生物过程,而该亚家族其它成员则鲜有报道。在本研究中,我们新克隆了一个B-bZIP亚家族成员OsbZIP81,并对其进行了深入研究;另外对本实验室之前研究的OsbZIP84进行了更进一步的研究。最终发现水稻中OsbZIP81.1可以直接作用于茉莉酸合成路径中的基因从而调控内源茉莉酸的合成,OsbZIP81.2能够与农杆菌毒力蛋白VirE2互作,找到并验证了OsbZIP81和OsbZIP84的响应元件OVRE,同时探究了OsbZIP84调控水稻株高的分子机理等,具体研究结果如下:运用RT-PCR的方法获得了OsbZIP81的三个可变剪接体,即OsbZIP81.1、OsbZIP81.2和...

【文章页数】：201 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略名词表
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 文献综述
        1.2.1 bZIP转录因子家族研究进展
            1.2.1.1 bZIP转录因子的结构特征
            1.2.1.2 拟南芥和水稻等植物中bZIP转录因子的分类
            1.2.1.3 水稻中bZIP转录因子与非生物胁迫
            1.2.1.4 水稻bZIP转录因子与生长发育和生物胁迫
        1.2.2 植物bZIP转录因子B亚家族成员研究进展
            1.2.2.1 水稻bZIP转录因子B(IX)亚家族成员研究进展
            1.2.2.2 拟南芥bZIP家族I亚家族成员VIP1 研究进展
            1.2.2.3 烟草bZIP家族成员RSG研究进展
        1.2.3 植物bZIP家族B亚家族成员结合的顺式元件研究进展
    1.3 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 水稻材料和来源
        2.1.2 烟草材料
        2.1.3 酵母双杂交文库
    2.2 菌株和载体
    2.3 载体构建及遗传转化
        2.3.1 载体的构建
        2.3.2 农杆菌介导的水稻愈伤遗传转化
        2.3.3 农杆菌介导的烟草叶片遗传转化
    2.4 植物基因组DNA的提取和转基因阳性材料的检测
    2.5 总RNA的提取、反转录和实时定量PCR
    2.6 RNA-Seq以及分析
    2.7 植物总蛋白的提取及Western Blot
    2.8 蛋白原核表达及纯化
    2.9 水稻原生质体中的亚细胞定位
    2.10 蛋白质与DNA结合分析
        2.10.1 染色质免疫共沉淀(ChIP)和ChIP-Seq数据分析
        2.10.2 随机DNA结合筛选分析
        2.10.3 凝胶阻滞实验(EMSA)
    2.11 蛋白相互作用分析
        2.11.1 酵母双杂交及酵母筛库
        2.11.2 双分子荧光互补(BiFC)
        2.11.3 Pull down
        2.11.4 Immunoprecipitation(IP)
    2.12 水稻原生质体双荧光素酶系统分析转录因子激活活性
3 结果与分析
    3.1 OsbZIP81 生物学功能分析
        3.1.1 OsbZIP81 生物信息学分析
        3.1.2 OsbZIP81 及其同源蛋白的进化关系分析
        3.1.3 OsbZIP81 三个转录本编码蛋白转录激活和自激活活性分析
        3.1.4 OsbZIP81.1、OsbZIP81.2和OsbZIP81.3 的亚细胞定位分析
        3.1.5 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 的时空表达模式
        3.1.6 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 可以形成同源或异源二聚体
        3.1.7 ObZIP81.1和OsbZIP81.2 受生物和非生物胁迫的诱导
        3.1.8 在酵母中OsbZIP81.2 能够与不同类型的毒力蛋白VirE2 互作
        3.1.9 OsbZIP81的bZIP结构域是潜在的VirE2 互作区域
        3.1.10 OsbZIP81.1和OsbZIP81.2 超表达转基因水稻材料的鉴定
        3.1.11 OsbZIP81 突变体的鉴定
    3.2 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 靶基因的鉴定
        3.2.1 ChIP-Seq检测OsbZIP81.1 全基因组范围内结合的基因
        3.2.2 OsbZIP81.1 结合的顺式作用元件的鉴定
        3.2.3 ChIP-qPCR验证ChIP-Seq结果
        3.2.4 RNA-Seq检测OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 调控的基因
        3.2.5 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 差异表达基因GO和KEGG富集分析
        3.2.6 OsbZIP81.1 靶基因的分析
        3.2.7 OsbZIP81.1 靶基因的GO和KEGG富集分析
        3.2.8 OsbZIP81.1 可能通过直接结合并调控茉莉酸合成路径上的基因从而调控茉莉酸的合成
        3.2.9 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 转基因烟草材料的构建
    3.3 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 互作蛋白的筛选
        3.3.1 OsbZIP81.2 互作蛋白的酵母文库筛选
        3.3.2 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 互作蛋白的筛选和质谱鉴定
        3.3.3 OsbZIP81.1 和OsbZIP81.2 与Y2H和IP-MS中部分基因的互作关系验证
    3.4 OsbZIP84 生物学功能分析
        3.4.1 OsbZIP84 的生物信息学分析
        3.4.2 OsbZIP84 时空表达模式和亚细胞定位研究
        3.4.3 OsbZIP84 超表达和基因敲除材料的构建和鉴定
        3.4.4 OsbZIP84 超表达和RNAi转基因植株表型分析
        3.4.5 OsbZIP84 受赤霉素和赤霉素抑制剂的抑制或诱导
        3.4.6 OsbZIP84 超表达植株和RNAi植株中GA合成路径和信号反馈路径部分基因表达量检测
        3.4.7 OsbZIP84 CRISPR/Cas9 转基因敲除植株的构建
        3.4.8 OsbZIP84 转录因子顺式元件的鉴定
4 讨论
    4.1 OsbZIP81 是一个可变剪接基因
    4.2 OsbZIP81.2 可能在农杆菌介导的水稻遗传转化中扮演了重要角色
    4.3 OsbZIP81 可能在水稻应对生物和非生物胁迫扮演了重要角色
    4.4 OVRE是一个新的水稻bZIP类转录因子顺式作用元件
    4.5 OsbZIP81 可能通过茉莉酸途径调控水稻的抗病反应
    4.6 OsbZIP84 可能通过赤霉素影响水稻的生长发育
    4.7 B-bZIP亚家族成员在功能上可能有冗余
    4.8 后续工作设想
参考文献
附录
    附录Ⅰ 附图
    附录Ⅱ 附表
    附录Ⅲ 部分实验的详细操作步骤及部分试剂配方
        Protocol 1 水稻原生质体的分离及转化
        Protocol 2 染色质免疫共沉淀(ChIP)
        Protocol 3 随机DNA结合筛选分析(Random DNA binding selectionassay, RDSA)
        Protocol 4 酵母双杂交文库筛选
        Protocol 5 农杆菌介导的水稻遗传转化(粳稻)
    附录Ⅳ 作者简介
致谢



本文编号：3882633