利用酵母双杂交筛选与丹参PPO互作的蛋白
发布时间：2024-04-20 04:56
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草属多年生草本植物,其根茎是我国传统中药,具有活血化瘀等功效。中药丹参水溶性有效成分主要以丹酚酸为主,其中又以丹酚酸B为代表。实验室前期研究表明丹参中多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)既能响应干旱胁迫,又能正向调控丹酚酸B积累,但其具体作用机制还不清楚。本试验试图通过分子生物学手段探索PPO的生理作用和表达特点,搜索与PPO相互作用的蛋白,通过正反向调控的方式研究PPO在丹参中可能带来的抗胁迫能力。通过试验得到以下结果:1.以丹参毛状根为材料提取RNA,反转录得到cDNA第一链,连接T载体,转化测序后提质粒,将T-PPO质粒与酵母表达载体pGBKT7经EcoR I,Nde I酶切,T4连接酶连接后,成功构建pGBKT7-PPO质粒。将pGBKT7-PPO重组质粒和pGBKT7分别转化Y2HGold酵母菌感受态,并涂SD/-Trp琼脂板培养,发现两者菌落的大小和数目相近,证明诱饵重组质粒对酵母无毒性。转化了的pGBKT7-PPO质粒的Y2HGold酵母菌感受态,稀释不同浓度涂SD/-Trp、SD...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 丹参
1.1.1 丹参概况
1.1.2 丹参的药用价值和研究现状
1.2 植物多酚氧化酶的研究进展
1.2.1 PPO基因结构
1.2.2 PPO基因的表达和调控
1.2.3 PPO的结构特点
1.2.4 PPO的生理特性
1.3 酵母双杂交
1.3.1 cDNA文库
1.3.2 酵母双杂交系统
1.4 研究方法
1.4.1 构建过表达与反义表达载体
1.4.2 转化
1.5 研究的目的及意义
1.6 技术路线
1.6.1 研究内容
1.6.2 技术路线
第二章 PPO互作蛋白筛选
2.1 试验材料
2.1.1 材料
2.1.2 菌株及质粒
2.1.3 试剂及试剂盒
2.1.4 引物和测序
2.1.5 常用试剂和培养基配制
2.2 试验方法
2.2.1 丹参总RNA提取
2.2.2 cDNA第一链的合成
2.2.3 目的基因的克隆
2.2.4 目的片段与T载体连接
2.2.5 连接产物的转化
2.2.6 单克隆菌落的检测
2.2.7 构建诱饵载体
2.2.8 诱饵载体自激活和毒性检测
2.2.9 酵母双杂交筛选与PPO相互作用的蛋白
2.2.10 文库滴度和鉴定
2.2.11 菌落PCR鉴定
2.2.12 去重复
2.2.13 提取酵母质粒
2.2.14 基因序列的测定与分析
2.3 结果分析
2.3.1 总RNA质量分析
2.3.2 重组诱饵质粒pGBKT7-PPO的表达与鉴定
2.3.3 酵母双杂交对照试验
2.3.4 重组诱饵质粒pGBKT7-PPO的毒性检测
2.3.5 重组诱饵质粒pGBKT7-PPO的自激活检测
2.3.6 文库滴度和插入片段长度鉴定
2.3.7 阳性克隆子筛选
2.3.8 阳性克隆子的PCR鉴定
2.3.9 阳性克隆酶切去重复
2.3.10 酵母质粒提取及转化大肠杆菌
2.3.11 阳性克隆测序分析
第三章 PPO过表达载体和反义载体的构建
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 菌株及质粒
3.1.3 试剂及试剂盒
3.1.4 引物和测序
3.1.5 常用试剂和培养基配制
3.2 试验方法
3.2.1 目的基因的克隆
3.2.2 目的片段与T载体连接
3.2.3 连接产物转化大肠杆菌
3.2.4 单克隆菌落的检测
3.2.5 过表达和反义载体的构建
3.2.6 转化根癌农杆菌
3.2.7 菌液制备
3.2.8 农杆菌介导的转化
3.3 结果分析
3.3.1 丹参无菌苗的培养
3.3.2 过表达和反义载体构建
3.3.3 转化农杆菌的阳性鉴定
3.3.4 叶盘法侵染
第四章 讨论
4.1 酵母双杂交
4.2 过表达和反义载体的构建及农杆菌侵染
第五章 结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3958909
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 丹参
1.1.1 丹参概况
1.1.2 丹参的药用价值和研究现状
1.2 植物多酚氧化酶的研究进展
1.2.1 PPO基因结构
1.2.2 PPO基因的表达和调控
1.2.3 PPO的结构特点
1.2.4 PPO的生理特性
1.3 酵母双杂交
1.3.1 cDNA文库
1.3.2 酵母双杂交系统
1.4 研究方法
1.4.1 构建过表达与反义表达载体
1.4.2 转化
1.5 研究的目的及意义
1.6 技术路线
1.6.1 研究内容
1.6.2 技术路线
第二章 PPO互作蛋白筛选
2.1 试验材料
2.1.1 材料
2.1.2 菌株及质粒
2.1.3 试剂及试剂盒
2.1.4 引物和测序
2.1.5 常用试剂和培养基配制
2.2 试验方法
2.2.1 丹参总RNA提取
2.2.2 cDNA第一链的合成
2.2.3 目的基因的克隆
2.2.4 目的片段与T载体连接
2.2.5 连接产物的转化
2.2.6 单克隆菌落的检测
2.2.7 构建诱饵载体
2.2.8 诱饵载体自激活和毒性检测
2.2.9 酵母双杂交筛选与PPO相互作用的蛋白
2.2.10 文库滴度和鉴定
2.2.11 菌落PCR鉴定
2.2.12 去重复
2.2.13 提取酵母质粒
2.2.14 基因序列的测定与分析
2.3 结果分析
2.3.1 总RNA质量分析
2.3.2 重组诱饵质粒pGBKT7-PPO的表达与鉴定
2.3.3 酵母双杂交对照试验
2.3.4 重组诱饵质粒pGBKT7-PPO的毒性检测
2.3.5 重组诱饵质粒pGBKT7-PPO的自激活检测
2.3.6 文库滴度和插入片段长度鉴定
2.3.7 阳性克隆子筛选
2.3.8 阳性克隆子的PCR鉴定
2.3.9 阳性克隆酶切去重复
2.3.10 酵母质粒提取及转化大肠杆菌
2.3.11 阳性克隆测序分析
第三章 PPO过表达载体和反义载体的构建
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 菌株及质粒
3.1.3 试剂及试剂盒
3.1.4 引物和测序
3.1.5 常用试剂和培养基配制
3.2 试验方法
3.2.1 目的基因的克隆
3.2.2 目的片段与T载体连接
3.2.3 连接产物转化大肠杆菌
3.2.4 单克隆菌落的检测
3.2.5 过表达和反义载体的构建
3.2.6 转化根癌农杆菌
3.2.7 菌液制备
3.2.8 农杆菌介导的转化
3.3 结果分析
3.3.1 丹参无菌苗的培养
3.3.2 过表达和反义载体构建
3.3.3 转化农杆菌的阳性鉴定
3.3.4 叶盘法侵染
第四章 讨论
4.1 酵母双杂交
4.2 过表达和反义载体的构建及农杆菌侵染
第五章 结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3958909
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/nzwlw/3958909.html