参与苹果花芽孕育调控的GA氧化酶和MdGAMYB的鉴定与分析

发布时间：2020-03-30 15:06

【摘要】：占我国苹果栽培面积70%的‘富士’品种成花难、大小年结果现象普遍发生,是产业转型升级的关键瓶颈问题之一。GA具有抑制苹果等木本植物成花的效应,苹果花芽孕育及大小年形成与幼果种子中合成的GA调控密切相关,相关调控机制有待深入解析。本研究通过对苹果赤霉素合成通路中的氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox进行全基因组鉴定与分析,测定其表达模式,筛选参与花芽孕育调控的候选基因,并进行克隆与分析;同时对GA信号转导途径中的MdGAMYB基因的表达模式、基因和启动子克隆序列、外源转化番茄的功能及互作蛋白进行研究分析。主要结果如下:1、苹果赤霉素氧化酶家族成员鉴定、进化、表达特性及候选成员的克隆。(1)从苹果基因组里鉴定出41个赤霉素氧化酶基因,其中GA2ox类20个,GA3ox类14个,GA20ox类7个;苹果表达量数据库组织特异性分析发现其在不同品种不同组织部位差异表达,其中花和果实中高表达。(2)结合生物信息学和‘长富2号’花芽孕育过程的转录组数据分析结果,挑选出8个表达较高的基因MdGA2ox4/6/9/12,MdGA3ox5/12和MdGA20ox1/5。GA_3处理后,花芽孕育不同时期GA20ox类氧化酶基因表达均下调,GA2ox类氧化酶基因表达均上调,GA3ox类氧化酶基因表达模式不一致,基本符合负反馈调节机制。PAC处理后,这3类基因表达整体下调,大部分基因表达不符合负反馈调节机制。(3)克隆了‘长富2号’和‘烟富6号’的MdGA2ox9、MdGA3ox12和MdGA20ox5基因,序列比对发现,2个品种中MdGA2ox9和MdGA20ox5的碱基序列完全一致,而MdGA3ox12基因在‘烟富6号’中克隆得到两种序列,存在2个氨基酸的突变,第66个氨基酸由缬氨酸(V)突变为亮氨酸(L),第137个氨基酸由精氨酸(R)突变为甘氨酸(G),且突变发生在的保守结构域区域。(4)对3个基因MdGA2ox9、MdGA3ox12和MdGA20ox5表达分析显示,这3个基因在不同组织中均有表达,MdGA2ox9和MdGA20ox5在花和芽中表达都相对较高;在难成花的‘长富2号’中赤霉素合成类的基因MdGA20ox5和MdGA3ox12较易成花‘烟富6号’表达更高,相反分解类基因MdGA2ox9则在‘长富2号’中表达较低;不同大小年花芽中,MdGA3ox12和MdGA20ox5在大年芽中均高于小年芽,MdGA2ox9则相反。这些结果暗示了它们可能参与苹果的花芽孕育和大小年调控。2、MdGAMYB基因编码区和启动子序列克隆,表达特性和功能分析。(1)克隆了苹果6个成花特性不同的栽培品种和2个砧木材料的MdGAMYB的序列,结果显示:8份材料中MdGAMYB的基因序列存在差异,蛋白比对结果显示,保守区域未发生较大差异。克隆了3个成花特性不同的苹果品种的MdGAMYB启动子序列,结果显示‘秦冠’与‘富士’品种(‘烟富6号’和‘玉华早富’)存在较大片段差异,启动子顺式作用元件分析发现,在不同品种中也出现了激素响应元件和光响应元件的差异。(2)表达模式分析发现,MdGAMYB在叶、花和芽中表达量较高;GA_3处理后,MdGAMYB的表达受到了显著抑制,在PAC处理后,则呈现相反趋势;在难成花的‘长富2号’中表达显著低于易成花的‘烟富6号’;在‘长富2号’大年、小年花芽中没有明显的趋势。这些结果表明MdGAMYB受GA的负调控,可能参与苹果花芽孕育。(3)在番茄中异源过表达MdGAMYB。结果发现过表达MdGAMYB转基因阳性番茄株系开花时间相较于野生型提前,且过表达阳性株系中与番茄花芽孕育相关基因的表达也受到显著的影响。为探讨MdGAMYB调控单性结实的功能,对苹果进行单性结实处理,结果表明在GA_(4+7)处理后15 d内,MdGAMYB的表达量显著低于授粉对照。处理后120 d的幼果中MdGAMYB的表达量显著高于授粉对照。3、MdGAMYB的酵母双杂交筛库获得39个阳性结果,经过序列比对和功能预测,获得3个激素相关的基因,3个在植物生长发育中发挥重要功能的基因和9个功能酶蛋白。
【图文】：

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已经总结出了调控植物开花的6条途径，包括：春化、自主、年龄、光周期、温敏、赤霉素途径（Mouradovet al. 2002）。这6条途径之间彼此独立又互相联系，形成了复杂精密的成花调控网络（张艺能等 2014）（图1-1 ）。植物经过系列复杂的信号转导，通过调控关键成花基因的表达从而实现对开花时间、数量、质量等方面的控制。图 1-1 拟南芥成花调控网络示意图（张艺能等 2014）Fig. 1-1 Schematic diagram of Arabidopsis flowering regulation network（张艺能等 2014）

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西北农林科技大学硕士学位论文4图1-2 拟南芥中GA调控的成花途径（Mutasa-Gottgens and Hedden 2009）Fig. 1-2 Flowering pathways regulated by GA in Arabidopsis（Mutasa-Gottgens and Hedden 2009）1.2 苹果花芽分化研究进展苹果花芽分化是形成果实的基础，花芽形成的质量对果实的品质、数量等具有重要的影响，花芽分化过程受内在（树体的营养基础、激素水平等）和外在（温度、气候等环境因素）等各种因素的影响（李烨 2009）。因此加强对苹果花芽分化的研究具有重要的意义。1.2.1 苹果花芽分化过程苹果的花芽分化过程比较复杂，，周期较长，从春梢停长前后，到翌年开花前直在进行，主要包括3个时期：生理分化期、形态分化期以及花芽进步发育期（性细胞形成期）（潘换来 2018）。其中生理分化期是苹果花芽形成的关键时期，在这时期芽的生长点发生了生理上的质变，是芽体发育的重要转折期，决定能否形成花芽，因此又被称作‘花芽孕育临界期’（潘换来 2018）。这关键时期起始于新梢长出顶芽或腋花芽后，枝条停止生长时，终止于花芽形态分化期开始之前（曹尚银等2001）
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.1

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