柑橘黄化苗光合特性研究、转录组分析及CitXET基因的挖掘

发布时间：2020-04-02 12:31

【摘要】：柑橘(Citrus)为芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Subfamily aurantioideae)的多年生植物,具有较高的食用价值与经济价值,是我国南方最重要的果树之一。针对植物叶片黄化的研究,大多集中在去黄化过程中不同代谢途径的调节、基因的差异表达、蛋白质翻译和遗传改良等方面,这些研究发现、提供了大量有关去黄化或转绿的基因和蛋白,有关于柑橘实生幼苗叶片黄化转录组测序的研究鲜有报道,并未进行黄化过程中叶绿体发育及光合作用代谢途径相关基因的研究。因此,了解幼苗黄化对光合参数的影响,并对不同黄化程度柑橘实生幼苗进行转录组分析,探究柑橘实生幼苗黄化过程中叶绿体发育及光合作用代谢途径相关基因的差异表达,了解XET基因对黄化幼苗生长的调控作用,对促进柑橘实生幼苗的正常生长、产业的健康发展都具有重大意义。1.以黄果柑、不知火幼苗为材料,分析黄化苗、花叶苗和绿叶苗的生长量、叶绿素含量、光合参数及叶绿素荧光特性的变化。结果表明,叶片黄化抑制了幼苗的正常生长,黄化苗的生长量显著低于绿叶苗;黄化苗叶片中游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白质(SP)含量均显著增加;叶片黄化显著降低了叶片叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)、类胡萝卜素(Car)含量和光合作用气体交换参数(净光合速率、气孔导度、胞间CO_2浓度、蒸腾速率),改变了叶绿素的组成比例。黄化苗的F_v/F_m、光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(NPQ)显著低于绿叶苗,导致净光合速率(P_n)显著降低,但花叶苗F_v/F_m下降程度较小。2.利用转录组测序技术,研究了不知火、黄果柑黄化幼苗叶片相关基因的差异表达,获得了8.34亿clean reads和125.12Gb的转录组测序数据,超过91.37%的reads达到Q30。12.4952万个unigenes的平均长度为1,189bp,分别有79.15%、84.35%、33.62%、63.12%、57.67%、57.99%和37.06%unigenes被注释到了NR、NT、KO、SwissProt、PFAM、GO和KOG数据库中。在不知火花叶苗和黄化苗中,鉴定了604个共同的差异表达基因,其中180个上调基因,424个下调基因;而黄果柑花叶苗和黄化苗中有1035个共同的差异表达基因,其中271个为上调基因,764个下调基因;两个柑橘品种的不同黄化程度幼苗中均未发现去黄化过程(GO:0009704);两个杂柑品种的花叶苗和黄化苗中有7个共同的上调基因、59个共同的下调基因,表明这些基因可能在杂柑幼苗黄化过程中发挥了非常重要的作用。3.为探究叶绿素合成途径与黄化的关系,根据转录组测序数据,对不知火、黄果柑的花叶苗和绿叶苗中与光合作用、叶绿素生物合成途径相关基因的表达、功能进行了分析。获得了5.67亿clean reads和85.05Gb的转录组测序数据,超过94.19%的reads达到Q30。同时,在不知火、黄果柑的花叶苗和绿叶苗中分别筛选出了4786和7007个差异表达基因。在这些差异调控通路中,有30个共同的代谢通路,包括有关光合作用(GO:0015979)和叶绿体代谢(GO:0009507)的途径。KEGG通路分析发现,与绿叶苗相比,不知火、黄果柑花叶苗的光合作用通路(KO 00195)中分别有44和63个差异表达基因,光合天线蛋白通路(KO 00195)中分别有14和29个差异表达基因,而黄酮类化合物的生物合成通路(KO 00941)中分别有16和29个差异表达基因。PsbQ、PetF、PetB、PsaA、PsaN、PsbP、PsaF和CitXET具有不同的表达模式,这可能与柑橘实生幼苗黄化有关。4.木葡聚糖转移酶(Xyloglucan endotransglycosylase,XET)在植物的生长和发育过程中具有非常重要的作用,为了探究XETs是否参与柑橘实生幼苗黄化过程中根、茎的伸长调控,本研究对黄果柑黄化苗CitXET基因的表达、XET酶活性进行了分析。结果表明,种子发芽15 d后,在黄化苗和花叶苗茎中CitXET基因是显著下调表达的,但在根冠顶端是显著上调表达的。通过NCBI保守结构域数据库(NCBI Conserved Domains Database,NCBI-CDD)、InterPro和ScanProsite分析表明,CitXET是糖基水解酶16家族(GH16)的成员,包括-DEIDFEFLG-特征序列。不同黄化程度柑橘实生幼苗的CitXET基因表达模式和XET酶活性有较大的差异,XET酶活性以及CitXET基因表达量的改变可能参与了幼苗黄化过程中根、茎的生长和发育。5.通过系统发育和分层聚类分析等方法分析了20个XET基因的4500个密码子使用偏性。结果表明20个XET基因分成两个组,这些基因中使用最多的四个密码子分别是AGA、AGG、AUC和GUG。另外,得到CitXET基因的8个最优密码子,即是AGA、AUU、UCU、CUU、CCA、GCU、GUU和AAA。碱基组成对密码子偏好性有较强的影响,这可能与XET基因功能有关。影响密码子使用偏性的主要因素(轴1和2)分别为54.8%和17.6%。PgXET、ZmXET、VlXET、VrXET和PcXET基因中GC含量相对较高,而CitXET、DpXET和BrpXET基因中GC含量相对较低。尽管XET基因也有一些密码子使用偏性,但不同XET基因通常表现出不同的密码子使用模式。XET基因的遗传距离越近,其密码子使用偏好性越相似。
【图文】：

黄化,幼苗,程度,光照

苗放入人工气候箱中（光照800 μmol·m-2 s-1，光周期为12:12 h，光照时温度为25 1℃夜间温度为 20 1℃，空气相对湿度为 50-60%）培养。于萌芽后 20 d，选取不知火和黄果柑黄化苗、花叶苗和绿叶苗为试验材料，，进行幼苗生长指标及光合作用参数的测定，试验样品详见图 2-1。

值分布,数据库,基因表达水平,情况

图 3-1 不知火、黄果柑 Unigenes 在 NCBI NR 数据库中的物种分类和 e-value 值分布情况Fig. 3-1 Species classification (A) and e-value distribution (B) of the unigenes of Shiranuhi aHuangguoganannotated to NCBI NR database.3.2.2 基因表达水平的评价
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S666

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