真菌病毒对梨轮纹病菌生物学特性、转录组和小RNA影响的研究

发布时间：2020-04-17 03:30

【摘要】：梨轮纹病是由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea(Moug:Fr)CesDe Not)引起的真菌病害,能够造成梨树枝条枯死、枝干粗皮和溃疡,果实腐烂。轮纹病在我国南北梨产区的危害呈逐年加重趋势。弱毒相关病毒导致植物病原真菌致病力衰退,可作为梨轮纹病生物防治的另一条重要途径。本研究对前期保存的复合感染产黄青霉病毒Botryosphaeria dothidea chrysovirus1 (BdCV1)和双分体病毒 Botryosphaeria dothidea partitivirus 1 (BdPV1)病毒的 LW-1菌株进行分离,旨在获得仅感染BdCV1菌株(命名为LW-C),评价该病毒对梨轮纹病菌分离株的影响;检测并分析来源于湖北省梨轮纹病菌分离株携带dsRNA病毒的多样性,挖掘防治梨轮纹病害的生防资源。以复合感染BdPV1和BdCV1的梨轮纹菌株LW-1、单独感染BdCV1的LW-C、单独感染BdPV1的LW-P以及无病毒感染的Mock菌株作为四组材料,构建了 4个文库(分别命名为LW-CP,LW-C,LW-P和Mock),进行de novo测序和小RNA测序,获得梨轮纹病菌unigene序列信息,分析病毒感染条件下梨轮纹病菌差异表达基因;结合采用小RNA高通量测序技术,以转录组数据库作为miRNA靶基因预测的数据库,对mRNA/miRNA进行了联合分析,研究结果旨在获得与真菌病毒互作和与梨轮纹病菌致病相关的关键基因和信号转导途径,挖掘防治梨轮纹病菌潜在的基因资源,为梨轮纹病害防治提供新途径。取得的具体研究结果如下::1.对与LW-1菌株来源于同一采集地'湖北省武汉市果树茶叶研究所砂梨种质资源圃'的梨树轮纹病害样品进行采集,经分离、纯化,菌落形态观察,分子鉴定及其致病力测定,结果表明,来源于湖北省的6个分离株均为强致病力梨轮纹病菌株B.dothdiea,经dsRNA检测,6个分离菌株均携带分子量为1-7kb之间多条dsRNA条带,存在病毒多样性;研究结果为探究真菌病毒防治梨轮纹病害提供生防资源以及真菌病毒分类和进化研究提供材料。2.通过单菌丝分离从LW-1菌株中获得仅感染BdCV1的梨轮纹病菌菌株(命名为LW-C),证实了 LW-C具有弱毒特性;水平转染结果明确了 BdCV1因子对梨轮纹菌菌落形态、生长速度有抑制作用,对梨轮纹病菌寄主有弱致病力。首次证实了产黄青霉病毒科BdCV1成员是引起梨轮纹菌株致病力衰退的主要因子,为真菌病毒防治果树轮纹病害提供了新颖的生防材料。3.采用 RT-qPCR 分析了 BdCV1 和 BdPV1 的 cp、RdRp基因在 LW-1、LW-C和LW-P菌株培养5 d、10 d、15d的相对表达量,结果显示BdCV1和BdPV1的cp、RdRp基因分别在各自单独感染和复合感染的梨轮纹病菌中表达量是有差异的,揭示了病毒间互作对其表达量有影响。4.构建了真菌病毒感染条件下梨轮纹病菌4个文库,对其进行了 De novo测序,共获得30,058个Unigene,平均长度为2,128bp,在7大基因数据库进行了注释,明确了功能分类。获得了 LW-CP/Mock上调表达基因5605个,下调基因3301个;LW-C/Mock上调表达基因4478个,下调基因4311个;LW-P/Mock上调表达基因2596个,下调基因2328个;以上结果表明,受BdCV1感染的差异表达基因数量最多,推测BdCV1对梨轮纹病菌寄主基因表达影响明显。采用RT-qPCR对病毒感染条件下候选的9个差异基因表达量进行分析,检测结果与转录组测序得到的表达趋势一致,验证了 RNA-seq测序结果的可靠性,明确了这些差异基因在病毒感染条件下的表达模式。另外,在梨轮纹病菌中检测到参与基因沉默途径的几个关键基因(Ago、Dicer和RdRp)且在病毒感染条件下均为上调表达。对病毒感染条件下3组对比文库的差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路分析,结果显示,这些基因主要在代谢途径以及生物合成二级代谢途径中显著富集,参与细胞复制、信号转导等抗病途径。5.小RNA高通量测序发掘真菌病毒感染响应梨轮纹病菌miRNAs的分析:miRNA长度大小以21和22nt为主,LW-CP、LW-C、LW-P和Mock文库中分别鉴定出63个、48个、83个和86个miRNAs。病毒感染条件下,3组对比文库 LW-CP/Mock, LW-C/Mock 和 LW-P/Mock 共有 110 个,120 个和88个差异表达的已知miRNAs。韦恩图结果显示,病毒感染条件下的3个对比文库中公有57个已知miRNA差异表达。另外,LW-CP、LW-C、LW-P和Mock文库中分别鉴定出25个,37个,20个和19个新的miRNA;新的miRNA在梨轮纹病菌文库中表达量较低。病毒感染条件下,LW-CP/Mock,LW-C/Mock和LW-P/Mock共有19个,15个和14个新的miRNAs差异表达;韦恩图结果显示,病毒感染条件下的3个对比文库中公有11个新的miRNA差异表达;新的miRNA成熟序列5'末端第一个碱基主要为U。6.病毒感染条件下梨轮纹病菌miRNA/mRNA负调控的联合分析结果显示,GO功能分析主要分为细胞组分、生物过程和分子功能共3种组群,涉及到代谢、细胞、催化反应、结合、转运等组分。KEGG功能分析的结果显示,这些差异表达miRNA负调控的靶基因主要涉及代谢,RNA降解、信号途径、ABC转运等途径,表明梨病毒感染条件下miRNA参与了梨轮纹病菌与真菌病毒互作。
【图文】：

菌落形态,菌株,湖北省,菌落形态

２．４．１．１来源于湖北省的梨轮纹病菌分离株的生物学培养特性逡逑２０１５年７月在‘湖北省武汉市果树茶叶研宄所砂梨种质资源圃’观察到梨树枝干逡逑上症状呈椭圆形轮纹状病斑，病斑边缘翘起，中间呈瘤状凸起（图１邋Ａ）。随机对逡逑其症状表现为梨轮纹病害的枝干经过分离、纯化的的１３个菌株中随机挑选出６个菌逡逑株，编号命名为邋ＨＢＷＨ－１，ＨＢＷＨ－３，邋ＨＢＷＨ－９，邋ＨＢＷＨ－１０，邋ＨＢＷＨ－１１邋和邋ＨＢＷＨ－１２，逡逑将其分别接种至新鲜的ＰＤＡ平板上，于２５°Ｃ黑暗培养观察分离菌落形态并对其生逡逑长速度进行测定。分离株在ＰＤＡ平板上菌丝初期为白色，后期变为灰绿色，菌丝气逡逑生性强（图邋１Ｂ），ＨＢＷＨ－３，邋ＨＢＷＨ－１０，邋ＨＢＷＨ－１１，邋ＨＢＷＨ－１，邋ＨＢＷＨ－９，邋ＨＢＷＨ－１２逡逑分离株的平均生长速率分别为９．８，１３．５，１３．７，１５．５，１６．１和１６．６邋ｍｍ／ｄ，３－４ｄ长满逡逑整平板，相比其他分离株，ＨＢＷＨ－３生长稍慢（图１邋Ｃ）。逡逑＿＿逡逑ＬＪ：Ｘ邋ＸＸＸＪ逡逑ＨＢＷＨ－１逦ＨＢＷＨ－３逦ＨＢＷＨ－９逦ＨＢＷＨ－１０逦ＨＢＷＨ－１１逦ＨＢＷＨ－１２逡逑图１邋Ａ来源于湖北省菌株梨轮纹病害症状（Ａ）；分离纯化菌株２５Ｃ，邋３ｄ在ＰＤＡ平板上逡逑的菌落形态（Ｂ）和生长速率测定（Ｃ）。逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋ｒｉｎｇ邋ｓｐｏｔ邋ｄｉｓｅａｓｅ邋ｏｎ邋ｐｅａｒ邋ｓｔｅｍ邋（Ａ）

阳性对照,琼脂糖凝胶电泳,公司,真菌病毒

需进一步随机克隆验证；ｄｓＲＮＡ检测结果表明，，来源于湖北省的梨轮纹病菌分离株逡逑携带真菌病毒存在多样性，随机选取的７个分离菌株带毒率为１００％，下一步需对该逡逑采样地的更多梨轮纹病菌分离株携带真菌病毒率及其种类进行调查（图４）。逡逑Ｍｌ邋２３逦４５６７８逦９逡逑Ｈ邋Ｏ邋Ｌｉ．邋ｌＡＬ邋ｉＪ逡逑图４梨轮纹病菌分离株携带ｄｓＲＮＡ检测的１．２％琼脂糖凝胶电泳图逡逑河为河虹１＜＾１１１（天根公司）；１为阳性对照１＾￥－１，２－８分别为１？＼￥１１－７，１＾＼￥１１－３，：＾胃－９，逡逑ＨＢＷＨ－１０，ＨＢＷＨ－１１，ＨＢＷＨ－１２邋和邋ＨＢＷＨ－１；邋９邋为阴性对照邋ＬＷ－３。，逡逑Ｆｉｇ．邋４邋Ｔｈｅ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｓＲＮＡ邋ｐａｔｔｅｒｎｓ邋ｂｙ邋１．２％邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｂ．邋ｄｏｔｈｄｉｅａ逡逑ｓｔｒａｉｎｓ邋ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋Ｈｕｂｅｉ邋Ｐｒｏｃｉｎｃｅ邋ｏｆ邋Ｃｈｉｎａ．逡逑Ｍ，邋ＤＮＡＭａｒｋｅｒ邋ＩＩＩ（Ｔｉａｎｇｅｎ）；邋１－９，ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＬＷ－１，邋ＨＢＷＨ－７，邋ＨＢＷＨ－３，邋ＨＢＷＨ－９，邋ＨＢＷＨ－１０，逡逑ＨＢＷＨ－１１，邋ＨＢＷＨ－１２，邋ａｎｄ邋ＨＢＷＨ－１邋ａｎｄ邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＬＷ－３，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．逡逑２．４．２邋ＬＷ－ｌ，ＬＷ－Ｃ和ＬＷ－Ｐ菌株垂直传播分生孢子的ｄｓＲＮＡ检测逡逑为了明确携带病毒的梨轮纹病菌分离株垂直传播分生孢子携带病毒情况，我们逡逑对保存的菌株ＬＷ－１，邋ＬＷ－Ｃ和ＬＷ－Ｐ进行诱导产孢。ＬＷ－１，ＬＷ－Ｃ和ＬＷ－Ｐ菌丝经逡逑３０邋ｄ诱导
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.612.1

【参考文献】