青瓯柑果实成熟衰老延缓调控机制研究

发布时间：2020-04-29 11:40

【摘要】：柑橘属于非跃变型果实,其成熟衰老机制及采后生物学特性有别于拟南芥等模式植物及水稻等大田作物,也不同于番茄和苹果等呼吸跃变型果实。目前对于柑橘果实成熟衰老的研究主要集中在对表型性状(果皮色泽、果肉糖酸及采后抗性能力等)的描述方面,对调控机制的认识还十分有限。本课题组前期已构建了柑橘果实采后衰老的分子调控网络,发现转录因子和激素子网络可能在柑橘果实成熟衰老中行使着重要功能,但还缺乏具体的实验数据支撑。因此,本研究依托普通瓯柑(Citrus reticulata cv.Suavissima)、其成熟衰老延缓突变体青瓯柑及青瓯柑回复突变为普通瓯柑果实为材料,系统地研究了果实成熟衰老过程的转录调控机制。此外本实验室前期研究表明水杨酸(Salicylic acid,SA)和油菜素内酯相关基因在青瓯柑和普通瓯柑果实贮藏期及不同柑橘种类贮藏期差异表达基因中呈现明显的富集趋势。为了探究这两种激素对柑橘采后衰老的影响,本研究以成熟的温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1)果实为材料,通过外源SA及油菜素内酯类似物24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide,EBR)处理,深入解析了它们对柑橘采后衰老的影响。主要研究结果如下:1.证明了青瓯柑是果实成熟衰老延缓突变体。对普通瓯柑、青瓯柑及回复突变材料果实成熟衰老相关表型分析发现,青瓯柑果实成熟衰老明显延缓,其有色层色泽转变、果肉含酸量下降等表型较普通瓯柑果实均显著延缓。对有色层叶绿素及类胡萝卜素定量后发现,青瓯柑中叶绿素及在叶绿体中积累的α、β-胡萝卜素及叶黄素下降速率显著减缓。作为有色层中β-胡萝卜素下游产物及成熟柑橘果实主要呈色色素,青瓯柑中β-隐黄质、玉米黄质及9-顺式紫黄质等色素含量显著低于普通瓯柑。普通瓯柑有色层中ABA含量随着果实成熟进程的推进而逐渐升高;青瓯柑有色层ABA含量并未伴随着成熟推进而升高,并且其浓度显著低于普通瓯柑有色层ABA浓度。青瓯柑与回复突变材料相关表型差异与青瓯柑和普通瓯柑果实类似。以上结果表明青瓯柑果实呈现出明显的成熟衰老延缓表型,并且其表型是由于α、β-胡萝卜素向下游转化延缓导致叶绿体转化及有色层呈色色素合成受阻,以及ABA合成延缓导致果实成熟衰老进程无法正常起始所致。2.转录因子CrMYB68和CrNAC036通过调控类胡萝卜素代谢及ABA合成,延缓了青瓯柑果实的成熟衰老。对青瓯柑和普通瓯柑果实发育期多个时间点类胡萝卜素及ABA代谢通路相关基因表达分析发现两者之间α、β-胡萝卜素转化及ABA合成延缓的差异是由于CrBCH2和CrNCED5在青瓯柑中持续下调表达所致。对前期转录组数据深入分析发现CrMYB68和CrNAC036两个转录因子的表达与CrBCH2和CrNCED5的表达呈显著负相关关系。这四个基因的表达差异在青瓯柑及其回复突变材料中得到进一步证实。通过选择性扩增结合位点分析(Selected amplification and binding,SAAB)实验证实CrMYB68蛋白能特异地结合到ACCTAC、ACCAAC和AACAAC序列上,而在CrBCH2和CrNCED5启动子中包含CrMYB68的潜在结合位点。本研究通过凝胶迁移实验(EMSA)证实CrMYB68能特异性结合到CrBCH2和CrNCED5启动子上;双荧光素酶实验表明CrMYB68能显著抑制CrBCH2和CrNCED5启动子活性。通过瞬时超量转化烟草(Nicotiana benthamiana)叶片及EMSA实验进一步证实CrMYB68同样能特异性结合到NbBCH2和NbNCED5启动子并抑制其基因的表达。对CrNAC036研究发现其能结合到CrNCED5启动子上并抑制其基因表达。而ABA所诱导的成熟衰老相关基因如参与类胡萝卜素合成的八氢番茄红素合成酶基因(CrPSY)、参与细胞壁降解的果胶裂解酶基因(CrPectate Lyase)和细胞壁伸展蛋白A1和A8基因(CrExpansin A1,A8)在青瓯柑中的表达量均低于普通瓯柑。以上结果表明青瓯柑果实成熟衰老延缓是由于CrMYB68及Cr NAC036在青瓯柑中高表达所致:一方面高表达的CrMYB68通过抑制CrBCH2基因的表达而影响α、β-胡萝卜素转化从而影响有色层叶绿体转化及有色层呈色色素合成;另一方面高表达的CrMYB68及CrNAC036通过抑制CrNCED5基因的表达而延缓ABA合成从而导致依赖ABA的果实成熟衰老进程无法正常起始。以上结果表明ABA在正调控柑橘成熟衰老进程中行使着重要功能,而综合分析本课题前期预实验、课题组前期调控网络及前人研究进展发现SA和油菜素内酯可能在负调控柑橘成熟衰老调控中发挥着重要作用。3.外源SA和EBR处理柑橘果实,可显著改善其采后贮藏性能。为了验证外源SA和EBR处理对柑橘采后性能的影响,本研究选择了在我国栽培面积最大,成熟衰老快且不耐贮藏的温州蜜柑果实为材料,进行后续研究。选用2 mmol L~(-1)SA以及10μmol L~-11 EBR分别处理已达商业成熟度的国庆一号温州蜜柑果实,并模拟生产进行贮藏实验和生理生化分析。结果表明:SA处理果实在贮藏50 d后腐烂率为对照果实的42.9%,并且显著延缓了果实贮藏期间硬度的下降。而对抗病相关代谢物含量分析发现,SA处理能显著诱导H_2O_2和多甲氧基黄酮的积累从而增强果实抗病能力。外源EBR处理后,贮藏50 d时处理果实腐烂率仅为对照果实的21.4%,但EBR处理对果实内在品质并没有显著影响。我们还发现经EBR处理后,果实存在一个快速失水的过程,此表型与发汗处理类似。进一步的实验证明,EBR处理后果实中H_2O_2、丝氨酸、苏氨酸、鸟氨酸和脯氨酸等化合物的积累以及几丁质酶基因(chitinase)、苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanin ammonia lyase)的表达均被诱导。这些代谢物的积累及基因的表达进一步增强了果实的抗病能力。
【图文】：

面色,胡萝卜素,番茄红素,八氢番茄红素

图 1-1 柑橘果实发育期果面色泽变化（Wang et al 2016a）。DPA：花后天数。Figure 1-2 The color transformation of citrus pericarp during the development stage (Wanget al 2016a). DPA: Days Post Anthesis.作为柑橘和芒果等果实的主要呈色色素，类胡萝卜素是形成果实外观品质的重要组成部分。在果实成熟过程中，大量类胡萝卜素以r{牛儿r{牛儿基焦磷酸（GGPP）为直接前体，合成直链态及环氧化胡萝卜素。在直链态胡萝卜素合成过程中由八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase，PSY）将两分子 GGPP 催化合成无色的八氢番茄红素的步骤是关键的限速步骤（图 1-2）（Lindgren et al2003,Cazzonelli and Pogson 2010）。随后在八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）催化下，八氢番茄红素发生脱氢反应并在ζ-胡萝卜素异构酶（Z-ISO）和胡萝卜素异构酶（CRTISO）作用下发生异构化最终产生粉红色的番茄红素（Bartley et al 1991,Isaacson et al 2002,Breitenbach and Sandmann 2004,Li etal 2007）。此后番茄红素在番茄红素ε环化酶（LCYe）及番茄红素β环化酶（LCYb）

合成反应,类胡萝卜素,高等植物,异构酶

类胡萝卜素主要合成反应（Cazzonelli and Pogson 2010）酸；HMBPP，4-羟基-2-甲基-2-己烯基 1 磷酸；IPP，异戊烯；GGPP，r{牛儿基r{牛儿基焦磷酸；DXS，1-脱氧-D-木酮-木酮糖-5-磷酸还原异构酶；HDS，羟甲基丁烯基-4-磷酸-二磷酸还原酶；IPI，异戊烯基二磷酸异构酶；GGPPS，PSY, 八氢番茄红素合成酶；PDS，八氢番茄红素脱氢酶TISO，胡萝卜素异构酶；β-LCY，番茄红素β-环化酶；ε-Le，β-胡萝卜素羟化酶；ε-OHase，，胡萝卜素ε-羟化酶；VD黄质环化酶；NXS，新黄质合成酶；CCD，胡萝卜素裂解双萝卜素双加氧酶。carotenoid biosynthesis reaction in higher plants. (Cazz2-C-methyl-derythritol 4-phosphate; HMBPP, 4-hydr IPP, isopentenyl diphosphate; DMAPP, dimethylallyl ddiphosphate;DXS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate se 5-phosphate reductoisomerase; HDS,hydroxymethylbuthydroxymethylbutenyl 4-diphosphate reductase; IPI, isopPS, geranylgeranyl diphosphate synthase; PSY, phytoenase; ZDS, ζ-carotene desaturase; CRTISO, carotene isomeras
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S666

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