产虾青素集胞藻PCC6803（Synechocystis sp.PCC6803）细胞工厂设计与构建

发布时间：2020-03-28 19:23

【摘要】：虾青素(astaxanthin,3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-β,β'-胡萝卜素,C_(40)H_(52)O_4)是一种次生类胡萝卜素,具有抗氧化、增强机体免疫力、抗癌、着色等作用,在食品及保健品、药品、饲料工业、化妆品等方面有着广泛的应用。虾青素主要是在藻源(雨生红球藻)、红发夫酵母及人工合成中通过各种方法进行合成。不同来源的虾青素结构不同。含虾青素的藻源主要为雨生红球藻。来自雨生红球藻的虾青素的结构是3S,3'S,属于100%的左旋结构,结构稳定,人或动物摄入体内后才能发挥一些重要的保护功能,最大程度上发挥其应有的多种生物功效。红发夫酵母中虾青素为3R,3'R,属于右旋,而人工合成虾青素含3S,3'S、3S,3'R、3R,3'R。在这3种虾青素结构中,左旋的抗氧化性最强,只有雨生红球藻能够通过生物合成途径合成。雨生红球藻在多种逆境胁迫条件下能够迅速合成并大量积累天然虾青素,其含量最高可达细胞干重的5%。因此,它是目前公认的合成天然虾青素的首选工具,但利用雨生红球藻大规模生产虾青素仍然是一个挑战,具有以下问题:生长周期长、生长速度慢、藻密度较低、占地面积广,而且易受到细菌和杂藻污染。为了提供另一种虾青素可用的来源,将集胞藻PCC6803用作底盘细胞,延伸类胡萝卜素生物合成途径以生产虾青素。集胞藻PCC6803具有培养条件较简单、生长速度较快、不会产生毒素、细胞结构较简单、遗传背景较清楚、方便于分子操作等有利于在光合生物反应器进行大规模生产的条件,是理想的蓝藻基因工程的受体。集胞藻PCC6803能够合成虾青素的上游底物海胆酮和玉米黄质,和雨生红球藻相比,缺乏合成虾青素的关键酶β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和类胡萝卜素羟化酶(CRTR-B),不能将海胆酮和玉米黄质进一步转化为虾青素。将来自雨生红球藻的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和类胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)根据集胞藻PCC6803的密码子偏好性进行了密码子优化,然后在集胞藻PCC6803中进行异源表达,之后通过基因组PCR,Southern blot,RT-PCR,Western blot验证bkt和crtR-B基因的表达,高效液相色谱检测发现转入bkt和crtR-B基因的突变株中产生了虾青素,虾青素的总量为0.68±0.01 mg/g(干重)。之后通过胁迫提高虾青素的产量,发现集胞藻PCC6803突变株在10%NaNO_3胁迫14天后虾青素总量达到4.81±0.06 mg/g(DW)。且游离虾青素占总虾青素的比例为30%以上,3S,3'S虾青素占总虾青素的比例为82.61%。这些结果证明了集胞藻PCC6803用于代谢工程生产虾青素的可用性和行业应用潜力。
【图文】：

集胞藻,类胡萝卜素,途径,β-胡萝卜素

第 1 章引言集胞藻 PCC6803 的类胡萝卜素合成途径在集胞藻 PCC6803 中，合成类胡萝卜素的途径(图 1.3)和雨生红球藻中萝卜素的途径相同，都是先通过非甲羟戊酸途径中合成异戊烯焦磷酸(异戊二烯途径合成类胡萝卜素的关键物质[48]。在集胞藻 PCC6803 中，胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物合成途径合成，异戊烯焦磷酸( IPP)的前体物质，异戊烯焦磷酸(IPP)经一步步催化生成 β-胡萝卜素，β-环rtR) 催化 β-胡萝卜素，使其经过羟基作用化生成 β-隐黄素，最终生成。β-胡萝卜素在 β-胡萝卜素转酮酶(crtO/crtW)催化下向海胆酮转化。

示意图,集胞藻,质粒,片段

第 2 章产虾青素集胞藻 PCC6803 的构建接下来，根据集胞藻 PCC6803 的密码子偏好性，由 GenScript 公司(中国)优化了 882bp crtR-B (GenBank：AF162276.1) 基因的密码子。以集胞藻 PCC6803基因组为模板扩增 PpsbA2启动子片段。然后使用融合 PCR 将 PpsbA2片段和 crtR-B 片段融合在一起，并插入到 p5ST1T2 质粒的 EcoRI 和 SalI 位点之间，经抗性筛选后提取质粒，将含 crtR-B 目的片段的质粒转入至集胞藻 PCC6803 野生株中，经连续抗性筛选直至 crtR-B 基因完全转入的突突株。crtR-B-p5ST1T2 载体构建示意图如图 2.1b 所示。上面使用的引物列于表 2.3 中。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q813

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