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桂花类胡萝卜素裂解关键基因CCD1的克隆及功能研究

发布时间:2020-04-20 13:38
【摘要】:类胡萝卜素及其衍生物不仅是许多抗逆物质生物合成的前体物,而且还调控植物花色、香气风味等,广泛应用于医药、卫生、食品、保健等行业。类胡萝卜素的裂解受类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase,CCDs)调控。CCDs是植物体内类胡萝卜素裂解代谢途径中的关键酶,含有9个成员,其中CCD1的调控机制最为复杂。为了深入研究桂花OfCCD1基因在香气生物合成中的生理功能,本研究采用RACE-PCR技术克隆桂花的OfCCD1基因,并进行核酸序列、蛋白质序列的分析,了解其结构特点;利用半定量PCR方法研究OfCCD1基因表达模式与含量变化,明确其表达规律;采用原核表达的方法进行诱导、纯化CCD1蛋白质,鉴定其氧化酶活性;利用叶盘法转化法和花序浸染法转化烟草和拟南芥,揭示其生理功能,取得如下实验结果:1、核酸序列分析结果表明,桂花OfCCD1基因的完整开放读码框(ORF)长度为1632 bp,编码的蛋白质序列含有543个氨基酸,分子式为C2785H4294N7200791S24,相对分子质量约为61288.52,理论等电点为6.27,脂溶指数80.77,总平均疏水指数为-0.262。其二级结构主要由α-螺旋(11.60%)、无规则卷曲(58.38%)、延伸链(23.76%)和β-转角(6.26%)组成,其蛋白质三维结构与玉米中的同源蛋白质VP14相似度最高;2、金桂、银桂、丹桂和四季桂OfCCD1基因均在香眼期时表达水平最低,依次在盛花初期、盛花中期、盛花中期和盛花初期时达到峰值,表明OfCCD1基因的表达丰度因桂花种类的不同而存在差异性表达,且具有时空特异性;3、0.5 M浓度的IPTG可以诱导OfCCD1蛋白的表达,通过镍柱纯化可以得到目的蛋白,分子量约为64KDa;同时利用His抗体进行鉴定,可以观察到目的条带,大小与目的蛋白相符合;4、采用叶盘法转化烟草植株,通过抗性筛选获得了抗性转基因植株,同时利用半定量PCR进行检测,可以扩增到OfCCD1基因;采用花序浸染法转化拟南芥植株(Col-0),获得了 OfCCD1过表达的阳性植株,为进一步研究OfCCD1的生理功能奠定了基础。
【图文】:

桂花,四季桂,反转录,花瓣


2.2结果与分析逡逑2.2.1桂花总RNA的提取逡逑提取桂花花瓣总RNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明(图3),逡逑28S邋rRNA及18S邋rRNA条带清晰,无降解,说明提取的RNA可以用于之逡逑后的反转录和PCR实验。逡逑11逡逑

还原酶,超氧化物,富马酸,螺旋桨轴


又非常有特色,在超氧化物还原酶、富马酸还原酶中常见。它由七叶片^逡逑螺旋桨组成,螺旋桨轴上的四个组氨酸,,可以固定Fe2+离子,从而标记逡逑酶活性中心(图8邋)。逡逑:S茫义贤迹稿澹埃茫茫模钡鞍酌富钚灾行腻义希疲椋纾福澹牛睿恚邋澹粒悖簦椋觯椋簦澹茫澹睿簦澹蝈澹铮驽澹希妫茫茫模戾义希保跺义

本文编号:2634602

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