HO-1下调导致细胞衰老及其表达调控的机制研究

发布时间：2020-04-29 20:39

【摘要】：血红素加氧酶(Hemeoxygenases,HO)是细胞中分解游离血红素的限速酶,已经在哺乳动物中发现了两种HO同工酶,分别为HO-1和HO-2。HO-1的表达由氧化应激诱导,在脾脏和肝脏中呈高水平表达,而HO-2的表达则主要在脑和睾丸中。血红素(Heme)是血红蛋白的辅基,结构上是含有一个亚铁离子的卟啉环。在细胞发生氧化应激时,一些血红蛋白会释放辅基Heme。游离Heme中的亚铁离子能够通过Fenton反应产生自由基,诱导HO-1的表达,保护细胞。HO-1对细胞的保护作用主要通过其分解Heme的产物保护细胞。HO-1能够催化分解游离的Heme产生成胆绿素,一氧化碳(CO)和游离铁。胆绿素在胆绿素还原酶的作用下形成胆红素,胆红素具有抗氧化作用,可以帮助细胞抵抗坏死并且胆红素能够抑制NF-κB介导的粘附分子的转录。这提示我们HO-1可能具有抵抗炎症的作用,在此过程中,HO-1分解Heme产生的游离铁诱导的铁蛋白可能也发挥着重要作用。在我们的研究中,衰老细胞中NF-κB激活,炎症因子分泌增加,HO-1表达被抑制,可能进一步激活NF-κB,促进细胞衰老。此外,HO-1表达被抑制导致细胞中Fe的重要来源被阻断,细胞增殖受阻。NRF2是HO-1的转录激活因子,NRF2是哺乳类动物最重要的抗氧化调控因子和解毒因子,它通过结合PRDX1,GSR,HO-1,FTH1等靶基因启动子序列的压力应答元件ARE,启动靶基因的转录,在细胞氧化应激中发挥极其重要的作用。我们发现,在衰老细胞中,NRF2的ARE结合活性被抑制,NRF2调控的下游靶基因的表达显著降低,细胞抗氧化能力下降,细胞ROS和线粒体的Mito-Sox水平显著升高。NF-κB是一种经典的促炎因子,在细胞衰老过程中促进衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)因子的表达。当被促炎细胞因子如肿瘤坏死因子刺激时,它又表现出抗凋亡作用。这可能也和它促衰老的作用密切相关。还有研究发现,ROS可以激活IκB激酶(IKK),释放NF-κB入核并促进IL-8和P53的激活,导致细胞衰老。有研究发现,在早老症患者细胞中,NF-κB能够通过竞争结合转录共激活因子CBP(CREB结合蛋白)-p300复合物抑制NRF2的活性。我们也同样发现,在衰老细胞中,NF-κB入核,p-p65蛋白水平增加,炎症反应增强。因而抑制了 NRF2的ARE结合活性,破坏了细胞抗氧化的保护机制,导致ROS水平升高,从而进一步激活NF-κB,为NF-κB的激活提供了持续的氧化应激环境,进一步促进细胞衰老。为了探究HO-1保护细胞抵抗衰老的机制,以及NRF2和NF-κB对它的调控作用,我们开展了以下研究工作。1.HO-1在衰老细胞中低表达我们分别用双氧水、HU、射线诱导NHF细胞发生衰老,通过Western blot检测几种衰老模型中,HO-1的表达均明显下调。同时我们还检测了传代衰老的NHF细胞中HO-1的表达也明显下调。2.HO-1敲低导致细胞衰老及其机制为了探究HO-1表达下调和细胞衰老的因果关系,干扰HO-1后,通过EdU掺入实验发现,细胞增殖能力明显下降。通过SA-β-gal衰老染色发现,衰老染色比例明显上升。用Hemin处理NHF细胞6、12、24、48h,发现HO-1的蛋白水平明显上调。用Hemin处理NHF细胞6h,检测ROS发现,ROS水平明显升高。用NAC联合Hemin处理NHF细胞,结果表明NAC能够明显抑制Hemin对HO-1的诱导表达。说明Heme升高ROS能够诱导HO-1上调分解Heme。若HO-1缺乏会导致Heme在细胞内积累。干扰HO-1后,通过流式细胞术检测细胞ROS水平,发现ROS水平升高。用Hemin处理正常NHF细胞和干扰HO-1的NHF细胞6天,SA-β-gal衰老染色发现,衰老染色比例上调。说明细胞缺乏HO-1导致ROS升高,Heme积累产生细胞毒性,升高ROS,促进细胞衰老。用DFO处理干扰HO-1的NHF细胞发现,细胞的衰老比例明显增加。用FAS处理干扰HO-1的NHF细胞,发现细胞的衰老比例明显下调。说明缺铁是HO-1缺乏导致细胞衰老的重要机制。3.衰老细胞中NRF2活性被抑制是HO-1表达下调的原因用双氧水处理双氧水诱导衰老的NHF细胞检测HO-1的蛋白水平,结果表明在衰老细胞中双氧水对HO-1的诱导表达能力明显减弱。我们通过干扰NRF2来模拟NRF2受损的NHF细胞并用双氧水和Hemin分别处理,结果表明干扰NRF2的细胞中过氧化氢和Hemin对HO-1的诱导表达能力明显减弱。接下来我们进一步检测了衰老细胞中其他NRF2靶基因的表达情况,分别用双氧水和HU诱导NHF 6天构建衰老模型,通过RT-PCR检测NRF2及NRF2靶基因的转录水平,结果显示NQO1、GSTM4、GCLC、GCLM、GSR、TXNDR1、TALDO、TKT的mRNA水平明显下降。通过检测NRF2-ARE荧光素酶报告基因发现,衰老细胞中NRF2-ARE结合活性显著下降。说明,在衰老细胞中NRF2-ARE结合活性受损,NRF2靶基因表达能力下降,细胞抗氧化能力下降,促进细胞衰老。4.衰老细胞中NF-κB负调控HO-1的表达发挥促氧化作用通过Western blot检测了传代衰老的NHF细胞中p-p65的蛋白水平明显上调。在传代衰老的NHF细胞中干扰P65,通过RT-PCR检测HO-1的表达水平,发现在正常和衰老细胞中干扰P65,HO-1的表达均明显上调。用双氧水诱导NHF细胞衰老模型,干扰P65后通过流式细胞术检测胞内ROS水平,发现干扰P65后ROS水平被下调。说明NF-κB在衰老细胞通过负调控HO-1的表达发挥促氧化作用,间接表明衰老细胞中NF-κB对NRF2有拮抗作用。5.在衰老细胞中NF-κB活性的维持需要持续的氧化应激通过流式细胞术检测了双氧水诱导的NHF衰老细胞和传代衰老的NHF细胞的ROS水平,与对照相比,衰老细胞的ROS水平均明显升高。用NAC处理双氧水、HU、IR分别诱导的衰老NHF细胞,通过RT-PCR检测炎症因子的表达发现,NAC处理后衰老细胞的炎症因子表达水平明显下降。说明衰老细胞中NF-κB活性的维持需要持续的氧化应激。
【图文】：

２．逦ＨＯ－１敲低导致细胞衰老逡逑为了探究Ｈ０－１表达下调和细胞衰老的因果关系，千扰Ｈ０－１后，通过ＥｄＵ逡逑掺入实验可以发现，细胞增殖能力明显下降（图２Ｂ）。干扰ＨＯ－１后正常培养逡逑ＮＨＦ细胞６天，通过ＳＡ－ｐ－ｇａｌ衰老染色发现，衰老染色比例比例明显上升（图逡逑２Ｃ）。说明ＨＯ－１缺乏导致细胞衰老。逡逑Ａ逡逑ＳＣＲ邋ｓｉＨＣＭ逡逑Ｈｏ＾Ｉ逡逑Ｌ—＿邋邋逦—逦——逡逑ｏａｐｄｈ逦ｆＨＨＭＰ逡逑３０逡逑

能会导致底物Ｈｅｍｅ的迅速累积以及胆红素的产生减少，进而升高细胞的ＲＯＳ逡逑水平促进细胞衰老。干扰ＨＯ－１后，通过流式细胞术检测细胞ＲＯＳ水平，结果逡逑表明缺乏ＨＯ－１导致细胞ＲＯＳ水平上升，，抗氧化能力下降（图４Ａ）。干扰ＨＯ－１逡逑后，用Ｈｅｍｉｎ处理细胞６天，通过ＳＡ－｜３－ｇａｌ衰老染色发现，衰老染色比例上调逡逑（图４Ｂ）。以上结果表明，正常情况下，细胞内产生的Ｈｅｍｅ会被ＨＯ－１迅速降逡逑解，产生的游离铁被铁结合蛋白结合不会产生细胞毒性。若细胞内缺乏ＨＯ－１，逡逑则会导致游离的Ｈｅｍｅ大量积累，升高ＲＯＳ，产生细胞毒性，从而促进细胞衰老。逡逑３２逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q255

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本文编号：2644974