适于棘尾虫（Stylonychia）基因功能研究的CRISPR技术研究

发布时间：2020-05-08 06:24

【摘要】：在棘尾虫属中以模式物种浮萍棘尾虫(Stylonychia lemnae)研究得最为深入。浮萍棘尾虫是研究细胞和分子生物学机制的重要生物,已经完成大核基因组测定,这使得棘尾虫属的基因功能研究成为可能。基因敲除是目前研究基因功能最为有效的手段。但在原生动物尤其是棘尾虫属的基因组上进行高效、精确的基因敲除来验证基因功能的研究缺乏参考资料。CRISPR/Cas9系统是近年来发展最快速的基因组编辑技术,它能够实现基因的定点编辑,因其更具高效性和灵活性而广受研究者青睐。创建适合棘尾虫的CRISPR/Cas9系统能够有效推动棘尾虫基因功能的研究。本研究从探讨棘尾虫密码子的偏好性入手,在棘尾虫中创建CRISPR/Cas9基因编辑系统,针对对棘尾虫AdSS基因的功能开展实验,以建立适合棘尾虫基因功能研究的CRISPR技术平台。主要结果如下:通过对棘尾虫第3位密码子的GC含量计算,发现第3位密码子富含A和U。通过对浮萍棘尾虫基因组进行PR2-plot绘图分析,发现第3位碱基T的使用频率高于A,C的使用频率高于G。结合中性绘图分析、ENC-plot绘图分析、PCA分析,发现浮萍棘尾虫基因组密码子偏好性受突变和自然选择的影响比较大,但与此同时也受到其他因素的影响,密码子偏好性是多因素影响的结果。最终通过高表达优越密码子方法确定AGA、GGA、UUA等24个密码子为最优密码子。通过PCR扩增方法在棘尾虫中克隆到一个注释为腺苷酸基琥拍酸合成酶的基因AdSS,通过核酸和蛋白序列比对,发现浮萍棘尾虫AdSS基因与第四双小核草履虫、多子小瓜虫和嗜热四膜虫高度同源。通过同时双酶切cDNA和pEGFP-N1载体的方法构建定位AdSS基因的载体,验证该基因主要位于细胞质的核糖体中。根据棘尾虫密码子偏好性分析得到的最优密码子改造载体中的Cas9蛋白,筛选出成功突变的质粒进行转染,与此同时对浮萍棘尾虫中的AdSS基因设计多个sgRNA打靶位点,成功获得1个sgRNA作用于目的基因,并产生大片段缺失。AdSS基因被敲除后,虫体的运动性明显降低,生长发育也受到影响,少量虫体产生畸形。为了检测敲除效率,利用实时荧光定量PCR技术完成对突变体的检测,证明该CRISPR/Cas9系统能够在棘尾虫中实现目标基因的编辑。综上所述,本研究筛选并验证棘尾虫的最优密码子,对敲除载体进行了优化,成功利用CRISPR/Cas9系统实现了对棘尾虫AdSS基因的特异敲除,证明该系统可有效应用于棘尾虫的基因组编辑,获得的具有稳定突变的细胞克隆和构建的CRISPR打靶载体为后续棘尾虫基因功能的研究奠定了坚实的基础。
【图文】：

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哈尔滨师范大学硕士学位论文因此，本研究以浮萍棘尾虫为研究对象，，以最新的基因敲除技术 CRISPR/Cas作为研究目标，探索适合于棘尾虫基因功能研究的 CRISPR 体系的构建，以期为自由生纤毛虫基因功能的研究提供技术支持和参考思路，更为真核生物基因的遗传进化分析奠定基础，也为进一步研究纤毛虫乃至高等动物细胞生命活动的分子生物学机制提供依据和参考。1.6 研究方案本研究首先在实验室建立浮萍棘尾虫原培养体系，然后用 G418 对浮萍棘尾虫进行抗性筛选，与此同时根据密码子偏好性研究得出的最优密码子来突变载体进而构建适合棘尾虫的敲除载体，然后根据靶点设计gRNA并构建识别靶点载体最后验证靶基因是否被敲除。具体技术路线如图 1-1：

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.5％的区间），则基因表达水平（表达）被鉴定为基因中 PC 评[50]。果码子组成分析 CodonW 软件对浮萍棘尾虫全基因组编码序列进行分析。浮萍含量范围为 22.1％ 58.6％，GC 含量主要分布在 25% 40%，表明基因组中有 AT 富集（见图 2-1）。ENC 的取值范围为 20～映的密码子偏性的强弱，当 ENC 为 20 时，表示同义密码子，表示同义密码子没有偏倚；按照惯例以 35 作为偏性强弱的区虫基因组 ENC 取值范围在 24.8~61 之间，并且大部分大于 4密码子偏性较弱。密码子第 3 位 GC 的平均含量为 33.7%，G8.68%和 30.1%，说明密码子碱基组成多为 A 和 U。
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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