大肠杆菌holo-ACP突变体的表达纯化及相应acyl-ACP的性质初探
发布时间：2021-11-25 12:26
酰基-酰基载体蛋白（acyl-acyl carrier protein,acyl-ACP）作为酰基供体,在脂肪酸、聚酮等天然产物合成途径中具有重要作用.目前,常以酰基-辅酶A（acyl-CoA）来代替尚未商品化的acyl-ACP进行相关酶的体外活性研究.由于底物蛋白acyl-ACP的ACP部分与相关酶发生相互作用,影响酶的催化特性,这种替代无法真实认识相关酶的酰基转移特性.本文以大肠杆菌pET-28a（+）-ACP为模板,构建12株单点突变体,表达纯化出相应holoACP,并进一步合成C16:0-ACP和C18:1-ACP.高效液相色谱的结果表明,ACP单点突变会影响acyl-ACP整体的性质,其中T40残基的改变对acyl-ACP的疏水性、紫外吸收响应和稳定性均产生了显著影响.ACP突变体的性质表征为acyl-ACP与相关酶的互作机制研究奠定了基础.
【文章来源】：北京理工大学学报. 2020,40(08)北大核心EICSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
不同物种来源的ACP序列同源性比较
通过SDS-PAGE分析12株holo-ACP突变体（图2），除I63R出现3个条带外，其余11株holoACP突变体均为单一条带，该条带出现在20kDa处，但holo-ACP的相对分子质量为11kDa，这是由于大肠杆菌ACP富含酸性阴离子氨基酸残基-天冬氨酸和谷氨酸，二者所占比例近50%，使得holo-ACP在SDS-PAGE中的迁移特征与常规蛋白质有所不同，这与文献[16]一致．可见，除I63R外的11株holo-ACP突变体均纯化成功（I63R的holoACP不再继续合成acyl-ACP),T64N的条带位置在其余10株突变体条带下方，与野生株（WT）有所不同，上述10株突变体的电泳迁移性质与WT类似．由表4可知，holo-ACP突变体表达过程中，先表达的apo-ACP进一步发生后修饰反应，生成holoACP,apo-ACP没有完全反应生成holo-ACP．除I63R的holo-ACP纯度只有49%外，WT和其余11株突变体的holo-ACP纯度在84%～99%之间．12株holo-ACP突变体中，I63R的蛋白获得量最低，为5.1mg/L,T40I,L47F,I55F和A60P与WT的蛋白获得量在同一水平，均在10mg/L以上，其余7株holo-ACP突变体的蛋白获得量在7～9mg/L之间．
其次，本文比较了各C16:0-ACP和C18:1-ACP突变体在HPLC中检测信号的单位峰面积所代表的物质的量（fmol/mAU）的差异（图3），以此来表征其在紫外吸收响应方面的性质差异，fmol/mAU越小，表明该蛋白的紫外吸收响应越强．由图3可知，单位点突变使大部分C16:0-ACP和C18:1-ACP突变体的紫外吸收响应增强，其中与WT相比，C16:0-ACP突变体在210nm处的紫外吸收响应差异较大的为T40L和A60P,C16:0-ACP的fmol/mAU分别只有WT的0.4和0.3倍，其余10株突变体与WT相近；对于C18:1-ACP，除Q15D和V30L外，其余10株突变体的紫外吸收响应均显著高于WT，特别是T40I,T40L和I55F，其C18:1-ACP的fmol/mAU分别只有WT的0.2,0.5和0.5倍．因此，T40氨基酸残基也使ACP的紫外吸收发生了明显的变化．最后，对acyl-ACP合成产物中C16:0-ACP和C18:1-ACP的纯度及其稳定性进行了评价．由图4可知，WT和大多突变体的C16:0-ACP纯度低于相应的C18:1-ACP纯度，表明ACP的单点突变对C16:0-ACP稳定性的影响更大．在11株ACP突变体中，C16:0-ACP和C18:1-ACP与WT之间纯度差异较大的为T40I,L47F,T53F和I55F，这4株突变体的C16:0-ACP纯度均在60%以下，C18:1-ACP纯度均在75%以下；其余7株突变体的纯度均等同于或高于WT．由表6可知，上述4株C16:0-ACP突变体经-80℃冻融后，其holo-ACP比例均提高至20%以上，相应的C18:1-ACP突变体经冻融后的holo-ACP比例提高至5%～10%之间，WT和其余7株突变体的holo-ACP比例变化不大．这些结果表明上述4株突变体的acyl-ACP易水解，性质相对不稳定．此外，上述4株holo-ACP突变体合成acyl-ACP后，所含apo-ACP比例会明显增大（表4和图4），这可能是在30℃合成反应期间ACP上Ser36的羟基与4’-PPT磷酸基之间的磷酯键水解造成的．可见，ACP的单点突变T40I,L47F,T53F和I55F会使acyl-ACP合成反应体系的不稳定性提高，还会影响其已合成C16:0-ACP和C18:1-ACP的水解，表明这些氨基酸残基在维持ACP的结构和性质稳定方面具有重要作用．根据ACP氨基酸位点的分布信息，T40和L47位于α2螺旋，T53和I55位于L2.Masoudi等研究[9]表明，ACP可通过调节α2螺旋、L2和α3螺旋的位置来控制其疏水空腔大小，以容纳不同链长的酰基，导致acyl-ACP整体构象发生改变．因此，本研究进一步表明了氨基酸残基T40、L47、T53和I55在维持ACP构象稳定中发挥的重要作用．
【参考文献】：
期刊论文
[1]Acyl-ACPs的规模化合成[J]. 丁威,冯延宾,曹旭鹏,薛松. 中国生物工程杂志. 2018(04)
本文编号：3518137
【文章来源】：北京理工大学学报. 2020,40(08)北大核心EICSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
不同物种来源的ACP序列同源性比较
通过SDS-PAGE分析12株holo-ACP突变体（图2），除I63R出现3个条带外，其余11株holoACP突变体均为单一条带，该条带出现在20kDa处，但holo-ACP的相对分子质量为11kDa，这是由于大肠杆菌ACP富含酸性阴离子氨基酸残基-天冬氨酸和谷氨酸，二者所占比例近50%，使得holo-ACP在SDS-PAGE中的迁移特征与常规蛋白质有所不同，这与文献[16]一致．可见，除I63R外的11株holo-ACP突变体均纯化成功（I63R的holoACP不再继续合成acyl-ACP),T64N的条带位置在其余10株突变体条带下方，与野生株（WT）有所不同，上述10株突变体的电泳迁移性质与WT类似．由表4可知，holo-ACP突变体表达过程中，先表达的apo-ACP进一步发生后修饰反应，生成holoACP,apo-ACP没有完全反应生成holo-ACP．除I63R的holo-ACP纯度只有49%外，WT和其余11株突变体的holo-ACP纯度在84%～99%之间．12株holo-ACP突变体中，I63R的蛋白获得量最低，为5.1mg/L,T40I,L47F,I55F和A60P与WT的蛋白获得量在同一水平，均在10mg/L以上，其余7株holo-ACP突变体的蛋白获得量在7～9mg/L之间．
其次，本文比较了各C16:0-ACP和C18:1-ACP突变体在HPLC中检测信号的单位峰面积所代表的物质的量（fmol/mAU）的差异（图3），以此来表征其在紫外吸收响应方面的性质差异，fmol/mAU越小，表明该蛋白的紫外吸收响应越强．由图3可知，单位点突变使大部分C16:0-ACP和C18:1-ACP突变体的紫外吸收响应增强，其中与WT相比，C16:0-ACP突变体在210nm处的紫外吸收响应差异较大的为T40L和A60P,C16:0-ACP的fmol/mAU分别只有WT的0.4和0.3倍，其余10株突变体与WT相近；对于C18:1-ACP，除Q15D和V30L外，其余10株突变体的紫外吸收响应均显著高于WT，特别是T40I,T40L和I55F，其C18:1-ACP的fmol/mAU分别只有WT的0.2,0.5和0.5倍．因此，T40氨基酸残基也使ACP的紫外吸收发生了明显的变化．最后，对acyl-ACP合成产物中C16:0-ACP和C18:1-ACP的纯度及其稳定性进行了评价．由图4可知，WT和大多突变体的C16:0-ACP纯度低于相应的C18:1-ACP纯度，表明ACP的单点突变对C16:0-ACP稳定性的影响更大．在11株ACP突变体中，C16:0-ACP和C18:1-ACP与WT之间纯度差异较大的为T40I,L47F,T53F和I55F，这4株突变体的C16:0-ACP纯度均在60%以下，C18:1-ACP纯度均在75%以下；其余7株突变体的纯度均等同于或高于WT．由表6可知，上述4株C16:0-ACP突变体经-80℃冻融后，其holo-ACP比例均提高至20%以上，相应的C18:1-ACP突变体经冻融后的holo-ACP比例提高至5%～10%之间，WT和其余7株突变体的holo-ACP比例变化不大．这些结果表明上述4株突变体的acyl-ACP易水解，性质相对不稳定．此外，上述4株holo-ACP突变体合成acyl-ACP后，所含apo-ACP比例会明显增大（表4和图4），这可能是在30℃合成反应期间ACP上Ser36的羟基与4’-PPT磷酸基之间的磷酯键水解造成的．可见，ACP的单点突变T40I,L47F,T53F和I55F会使acyl-ACP合成反应体系的不稳定性提高，还会影响其已合成C16:0-ACP和C18:1-ACP的水解，表明这些氨基酸残基在维持ACP的结构和性质稳定方面具有重要作用．根据ACP氨基酸位点的分布信息，T40和L47位于α2螺旋，T53和I55位于L2.Masoudi等研究[9]表明，ACP可通过调节α2螺旋、L2和α3螺旋的位置来控制其疏水空腔大小，以容纳不同链长的酰基，导致acyl-ACP整体构象发生改变．因此，本研究进一步表明了氨基酸残基T40、L47、T53和I55在维持ACP构象稳定中发挥的重要作用．
【参考文献】：
期刊论文
[1]Acyl-ACPs的规模化合成[J]. 丁威,冯延宾,曹旭鹏,薛松. 中国生物工程杂志. 2018(04)
本文编号：3518137
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3518137.html
教材专著
