利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系

发布时间：2021-12-22 05:03

　　目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾（human embryonic kidney cell,HEK-293）细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA（single-guide RNA,sgRNA）,构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基... 

【文章来源】：解剖科学进展. 2020,26(03)

【文章页数】：4 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞系和主要试剂
    1.2 pLenti-DOC-1R-sgRNA-Cherry重组表达载体的构建与鉴定
    1.3 DOC-1R慢病毒的制备及感染
    1.4 细胞总蛋白的提取、电泳及Western blot检测
2 结果
    2.1 pLenti-DOC-1R-sgRNA-Cherry表达载体构建
    2.2 在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达情况
    2.3 Western blot检测HEK-293细胞中DOC-1R表达
3 讨论



本文编号：3545812