人源SPINK6在大肠杆菌中的表达优化

发布时间：2022-01-05 02:31

　　丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型6（serine protease inhibitor Kazal-type 6,SPINK6）蛋白是医学上的重要蛋白。为了高效制备具有生物活性的SPINK6蛋白,使用大肠杆菌表达系统重组表达SPINK6蛋白,经过纯化和酶切后测定了其生物活性,并对其表达条件进行了优化。结果表明,飞行时间质谱测得产物的分子量为6 061.51 Da,通过此法成功制备获得了重组SPINK6蛋白,并且重组SPINK6蛋白对激肽释放酶相关肽酶5（kallikrein-related peptidase 5,KLK5）（K_i=3.02±0.26 nmol/L）和KLK14（K_i=1.85±0.05 nmol/L）有较强的抑制作用,具有生物活性。采用pE-SUMO3质粒为载体,在菌体OD₆₀₀=0.4时加入1 mmol/L异丙基-β-D硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达3 h,重组SPINK6蛋白获得最大表达量,1 L培养液中获得重组SPINK6 3... 

【文章来源】：浙江科技学院学报. 2020,32(06)

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

SPINK6基因的转录本扩增

为了重组表达SPINK6融合蛋白,我们将构建好的表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG诱导下进行了表达。SDS-PAGE检测结果表明在约20千道尔顿(kilo Dalton,kDa)和24 kDa处有2条较强蛋白条带(结果未显示),阴性对照在相应的位置无蛋白条带。随后,我们对细胞裂解液进行了2步分离纯化。图2(a)显示了Ni2+-NTA纯化的洗脱曲线,随着流动相B的增加,在22～30 min获得1个洗脱峰,在Ni2+-NTA纯化过程中,大多数杂质直接流穿,而SPINK6重组融合蛋白因带有His标签而保留在柱上,因此分析该峰为SPINK6重组融合蛋白的洗脱峰。如图2(b)显示,出峰产物通过进一步的制备RP8-HPLC纯化,在38～42 min得到1个洗脱峰,反相高效液相色谱是通过物质的不同极性将物质分离,Ni2+-NTA纯化后留下了SPINK6重组融合蛋白和咪唑等盐类物质,咪唑等盐类物质极性较大先被洗脱下来,而SPINK6重组融合蛋白极性较小,后被洗脱下来,因此分析38～42 min的峰为SPINK6重组融合蛋白的洗脱峰。2.3 SPINK6重组融合蛋白的酶切和鉴定

2.3 SPINK6重组融合蛋白的酶切和鉴定为获得SPINK6重组蛋白,4 ℃下酶切10 h时重组融合蛋白被完全消化,由图3(a)可知产生约11 kDa和6 kDa的两个条带,分别对应接头蛋白和目的蛋白。进一步对酶切产物进行RP4-HPLC纯化分析,洗脱峰进行ESI-MS检测,其m/z值分布在758.73至1 516.20之间(结果未显示)。通过最大熵反褶积得到了如图3(b)所示的分子量图谱,显示酶切后的产物分子量为6 061.51 Da。该分子量同预期的SPINK6理论分子量6 067.83 Da相比,少了6.32 Da,这对应6个H原子的质量总和,这表明表达的SPINK6重组蛋白带有3个二硫键[4]。


本文编号：3569548