利用Crispr/Cas9技术构建影响先天性心脏病关键基因的表达载体
发布时间：2022-02-09 00:44
目的利用Crispr/Cas9技术构建影响先天性心脏病关键基因表达载体,为后续基因编辑工作做好前期分子实验基础。方法利用NCBI数据库检索调控先天性心脏病关键基因NKX2-5、GATA4、TBX5,通过生物软件在线设计3个基因对应的sgRNA。对慢性病毒载体lentiCRISPRv2进行BsmB I单酶切,通过胶回收获得线性化载体。利用T4连接酶将处理后的双链sgRNA和载体连接,通过大肠杆菌转化、质粒提取和测序最终得到lentiCRISPRv2-NKX2-5、lentiCRISPRv2-GATA4、lentiCRISPRv2-TBX5 3种病毒表达载体。结果获得评分最高且碱基数量合适的sgRNA,通过对表达载体的线性化酶切,成功去除载体中2 000 bp左右的置换片段,对连接后的载体测序显示双链sgRNA与病毒表达载体置换片段序列一致。结论利用Crispr/Cas9可成功构建先天性心脏病关键基因NKX2-5、GATA4、TBX5病毒表达载体。
【文章来源】：兰州大学学报(医学版). 2020,46(01)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
sgRNA序列
利用T4连接酶将sgRNA双链和载体长片段混匀后置于4°C过夜反应，见图1。反应体系：T4连接酶1μL,T4 Buffer 5μL，回收载体2μL，目的基因2μL。12～16 h后将连接产物转化进入DH5a感受态，方法：将连接后的感受肽均匀涂布于LB(Luria-Bertani）固体培养基（AMP100μg/mL），晾干后倒置于37°C恒温培养过夜。隔日挑选单一白色菌落接种于液体LB培养基（AMP100μg/mL），振荡（37°C,150 r/min）培养。使用超纯质粒DNA纯化试剂盒提取质粒，送至诺禾致源科技股份有限公司测序。2 结果
利用BsmB I内切酶分别酶切3份载体，Marker作为片段大小参照，见图2；对照质粒没有被酶切，在酶切质粒中分别得到一条2 000 bp左右的条带，该条带即为置换片段，后续工作只需回收载体长片段即可。2.3 载体回收
【参考文献】：
期刊论文
[1]NKX2-5、TBX5、GATA4基因与先天性心脏病关系研究进展[J]. 杜佳,易岂建. 儿科药学杂志. 2018(05)
[2]Nodal信号通路、Nodal纤毛与先天性心脏病研究进展[J]. 孙晓玮,张建刚,谢小冬. 兰州大学学报(医学版). 2015(04)
[3]GATA4基因多态性与先天性心脏病相关性研究[J]. 尤涛,丁兆红,刘兴光,王新宽,侯小东,丁凡,移康. 兰州大学学报(医学版). 2015(01)
本文编号：3616062
【文章来源】：兰州大学学报(医学版). 2020,46(01)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
sgRNA序列
利用T4连接酶将sgRNA双链和载体长片段混匀后置于4°C过夜反应，见图1。反应体系：T4连接酶1μL,T4 Buffer 5μL，回收载体2μL，目的基因2μL。12～16 h后将连接产物转化进入DH5a感受态，方法：将连接后的感受肽均匀涂布于LB(Luria-Bertani）固体培养基（AMP100μg/mL），晾干后倒置于37°C恒温培养过夜。隔日挑选单一白色菌落接种于液体LB培养基（AMP100μg/mL），振荡（37°C,150 r/min）培养。使用超纯质粒DNA纯化试剂盒提取质粒，送至诺禾致源科技股份有限公司测序。2 结果
利用BsmB I内切酶分别酶切3份载体，Marker作为片段大小参照，见图2；对照质粒没有被酶切，在酶切质粒中分别得到一条2 000 bp左右的条带，该条带即为置换片段，后续工作只需回收载体长片段即可。2.3 载体回收
【参考文献】：
期刊论文
[1]NKX2-5、TBX5、GATA4基因与先天性心脏病关系研究进展[J]. 杜佳,易岂建. 儿科药学杂志. 2018(05)
[2]Nodal信号通路、Nodal纤毛与先天性心脏病研究进展[J]. 孙晓玮,张建刚,谢小冬. 兰州大学学报(医学版). 2015(04)
[3]GATA4基因多态性与先天性心脏病相关性研究[J]. 尤涛,丁兆红,刘兴光,王新宽,侯小东,丁凡,移康. 兰州大学学报(医学版). 2015(01)
本文编号：3616062
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3616062.html
