黑曲霉cpeB和catA基因对氧化应激和果实致病性的调控机制研究
发布时间：2022-02-26 00:14
黑曲霉（Aspergillus niger）,一种在自然界普遍存在的丝状真菌,因其可以产生有机酸、酶类和多种次级代谢产物,故在工业生产中具有重要的应用价值;同时作为一种典型的致腐真菌,能够造成食品、植物、果蔬的腐烂变质。外界氧化胁迫导致黑曲霉细胞内活性氧（ROS）的大量积累,为抵抗ROS造成的氧化损伤,黑曲霉抗氧化系统中的过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）在其中发挥着重要作用。本论文利用同源重组原理,结合原生质体转化技术,构建黑曲霉ΔcpeB、ΔcatA、ΔcpeB-ΔcatA和ΔcpeB-ΔsodC缺失体,以探究黑曲霉中cpeB和catA基因对氧化应激和果实致病性的调控机制。主要研究结果如下:首先,对过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因cpeB在氧化应激和对果实的致病力中的作用进行了探究。鉴于cpeB基因可能参与黑曲霉的抗氧化代谢过程,利用RT-qPCR技术对cpeB基因在氧化应激反应中的作用进行探究,发现在外源H2O2胁迫下,黑曲霉cpeB基因的相对表达量是正常条件下的3.87倍。通过对过氧化氢酶-过氧化物酶cpeB进行生物信息学分...
【文章来源】：合肥工业大学安徽省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 前言
1.1 黑曲霉研究概述
1.2 病原真菌氧化应激和ROS的产生
1.3 植物免疫防御及致病真菌的响应机制
1.4 真菌中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的研究进展
1.4.1 过氧化氢酶在真菌中的研究进展
1.4.2 超氧化物歧化酶在真菌中的研究进展
1.5 真菌基因工程研究进展
1.6 课题研究的目的、意义及内容
1.6.1 研究目的与意义
1.6.2 研究内容
第二章 黑曲霉cpeB缺失体的构建及基因的功能研究
2.1 实验材料、试剂及仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 总RNA的提取
2.2.2 cDNA的合成
2.2.3 引物的设计及RT-qPCR检测
2.2.4 黑曲霉cpeB基因的生物信息学分析
2.2.5 黑曲霉cpeB敲除载体的构建
2.2.6 黑曲霉原生质体的制备及聚乙二醇的转化
2.2.7 黑曲霉ΔcpeB突变体的筛选
2.2.8 ΔcpeB突变体的鉴定
2.2.9 黑曲霉ΔcpeB突变体过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性的检测
2.2.10 黑曲霉ΔcpeB突变体CAT同工酶活性电泳的检测
2.2.11 黑曲霉ΔcpeB突变体菌丝体生长状况的测定
2.2.12 黑曲霉ΔcpeB突变体生长曲线的测定
2.2.13 不同非生物胁迫下ΔcpeB突变体的敏感性测定
2.2.14 H_2O_2 胁迫下孢子萌发的测定
2.2.15 MDA、H_2O_2 含量以及·O_2~-产生速率的测定
2.2.16 黑曲霉侵染采后果实能力的检测
2.3 结果与分析
2.3.1 H_2O_2 胁迫下黑曲霉cpeB基因的应答
2.3.2 黑曲霉cpeB基因的生物信息学分析
2.3.3 黑曲霉cpeB pC3-ABCD敲除载体的构建
2.3.4 黑曲霉cpeB缺失体的鉴定及酶活分析
2.3.5 黑曲霉野生型与cpeB缺失体生长状况的比较
2.3.6 ΔcpeB突变体对不同非生物胁迫的敏感性分析
2.3.7 H_2O_2对ΔcpeB突变体孢子萌发的影响
2.3.8 H_2O_2 胁迫下ΔcpeB体内MDA、H_2O_2 含量以及·O_2~-产生速率的分析
2.3.9 黑曲霉WT与 cpeB缺失体对苹果果实的致病性分析
2.4 本章小结
第三章 cpeB-catA双基因突变体的构建及其抗氧化功能和对果实的致病性研究
3.1 实验材料、试剂及仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 实验方法
3.2.1 RT-qPCR测定H_2O_2胁迫下CAT家族基因的表达量
3.2.2 黑曲霉CAT家族基因进化树的构建
3.2.3 黑曲霉catA、An03g05660和An14g07200 敲除载体的构建
3.2.4 ΔcatA和 ΔcpeB-ΔcatA突变体的鉴定
3.2.5 可溶性蛋白含量的测定
3.2.6 过氧化氢酶(CAT)同工酶活性电泳的检测
3.2.7 黑曲霉对不同非生物胁迫的敏感性测定
3.2.8 扫描电子显微镜观察黑曲霉菌丝形态
3.2.9 黑曲霉野生型和突变体对果实侵染能力的测定
3.3 结果与分析
3.3.1 H_2O_2胁迫下CAT家族编码基因的应答
3.3.2 CAT家族基因进化树分析
3.3.3 catA、An03g05660、An14g07200 基因侧翼片段AB、CD的扩增及纯化
3.3.4 片段ABCD的扩增
3.3.5 ABCD片段和pC3 质粒的酶切
3.3.6 ABCD片段与pC3 质粒的连接及鉴定
3.3.7 ΔcpeB-ΔcatA双基因缺失体的鉴定及酶的活性分析
3.3.8 ΔcpeB-ΔcatA对不同非生物胁迫的敏感性分析
3.3.9 H_2O_2 对黑曲霉菌丝超显微形态的影响
3.3.10 ΔcpeB-ΔcatA对采后水果的致病性分析
3.4 本章小结
第四章 cpeB-sodC双突的构建及其对黑曲霉抗氧化能力的影响
4.1 实验材料、试剂及仪器
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 ΔcpeB-ΔsodC双突变体的筛选及鉴定
4.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)同工酶活性电泳的检测
4.2.3 ΔcpeB-ΔsodC对不同非生物胁迫的耐受力测定
4.2.4 甲萘醌胁迫下SOD家族基因的表达水平的测定
4.3 结果与分析
4.3.1 ΔcpeB-ΔsodC缺失体的鉴定及酶活分析
4.3.2 ΔcpeB-ΔsodC对不同非生物胁迫的耐受力分析
4.3.3 黑曲霉野生型和ΔsodC中 SOD家族编码基因对甲萘醌胁迫的应激响应
4.4 本章小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
【参考文献】：
硕士论文
[1]石榴腐烂病害综合防治技术研究及病原菌的分离鉴定[D]. 付娟妮.西北农林科技大学 2005
本文编号：3643966
【文章来源】：合肥工业大学安徽省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 前言
1.1 黑曲霉研究概述
1.2 病原真菌氧化应激和ROS的产生
1.3 植物免疫防御及致病真菌的响应机制
1.4 真菌中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的研究进展
1.4.1 过氧化氢酶在真菌中的研究进展
1.4.2 超氧化物歧化酶在真菌中的研究进展
1.5 真菌基因工程研究进展
1.6 课题研究的目的、意义及内容
1.6.1 研究目的与意义
1.6.2 研究内容
第二章 黑曲霉cpeB缺失体的构建及基因的功能研究
2.1 实验材料、试剂及仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 总RNA的提取
2.2.2 cDNA的合成
2.2.3 引物的设计及RT-qPCR检测
2.2.4 黑曲霉cpeB基因的生物信息学分析
2.2.5 黑曲霉cpeB敲除载体的构建
2.2.6 黑曲霉原生质体的制备及聚乙二醇的转化
2.2.7 黑曲霉ΔcpeB突变体的筛选
2.2.8 ΔcpeB突变体的鉴定
2.2.9 黑曲霉ΔcpeB突变体过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性的检测
2.2.10 黑曲霉ΔcpeB突变体CAT同工酶活性电泳的检测
2.2.11 黑曲霉ΔcpeB突变体菌丝体生长状况的测定
2.2.12 黑曲霉ΔcpeB突变体生长曲线的测定
2.2.13 不同非生物胁迫下ΔcpeB突变体的敏感性测定
2.2.14 H_2O_2 胁迫下孢子萌发的测定
2.2.15 MDA、H_2O_2 含量以及·O_2~-产生速率的测定
2.2.16 黑曲霉侵染采后果实能力的检测
2.3 结果与分析
2.3.1 H_2O_2 胁迫下黑曲霉cpeB基因的应答
2.3.2 黑曲霉cpeB基因的生物信息学分析
2.3.3 黑曲霉cpeB pC3-ABCD敲除载体的构建
2.3.4 黑曲霉cpeB缺失体的鉴定及酶活分析
2.3.5 黑曲霉野生型与cpeB缺失体生长状况的比较
2.3.6 ΔcpeB突变体对不同非生物胁迫的敏感性分析
2.3.7 H_2O_2对ΔcpeB突变体孢子萌发的影响
2.3.8 H_2O_2 胁迫下ΔcpeB体内MDA、H_2O_2 含量以及·O_2~-产生速率的分析
2.3.9 黑曲霉WT与 cpeB缺失体对苹果果实的致病性分析
2.4 本章小结
第三章 cpeB-catA双基因突变体的构建及其抗氧化功能和对果实的致病性研究
3.1 实验材料、试剂及仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 实验方法
3.2.1 RT-qPCR测定H_2O_2胁迫下CAT家族基因的表达量
3.2.2 黑曲霉CAT家族基因进化树的构建
3.2.3 黑曲霉catA、An03g05660和An14g07200 敲除载体的构建
3.2.4 ΔcatA和 ΔcpeB-ΔcatA突变体的鉴定
3.2.5 可溶性蛋白含量的测定
3.2.6 过氧化氢酶(CAT)同工酶活性电泳的检测
3.2.7 黑曲霉对不同非生物胁迫的敏感性测定
3.2.8 扫描电子显微镜观察黑曲霉菌丝形态
3.2.9 黑曲霉野生型和突变体对果实侵染能力的测定
3.3 结果与分析
3.3.1 H_2O_2胁迫下CAT家族编码基因的应答
3.3.2 CAT家族基因进化树分析
3.3.3 catA、An03g05660、An14g07200 基因侧翼片段AB、CD的扩增及纯化
3.3.4 片段ABCD的扩增
3.3.5 ABCD片段和pC3 质粒的酶切
3.3.6 ABCD片段与pC3 质粒的连接及鉴定
3.3.7 ΔcpeB-ΔcatA双基因缺失体的鉴定及酶的活性分析
3.3.8 ΔcpeB-ΔcatA对不同非生物胁迫的敏感性分析
3.3.9 H_2O_2 对黑曲霉菌丝超显微形态的影响
3.3.10 ΔcpeB-ΔcatA对采后水果的致病性分析
3.4 本章小结
第四章 cpeB-sodC双突的构建及其对黑曲霉抗氧化能力的影响
4.1 实验材料、试剂及仪器
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 ΔcpeB-ΔsodC双突变体的筛选及鉴定
4.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)同工酶活性电泳的检测
4.2.3 ΔcpeB-ΔsodC对不同非生物胁迫的耐受力测定
4.2.4 甲萘醌胁迫下SOD家族基因的表达水平的测定
4.3 结果与分析
4.3.1 ΔcpeB-ΔsodC缺失体的鉴定及酶活分析
4.3.2 ΔcpeB-ΔsodC对不同非生物胁迫的耐受力分析
4.3.3 黑曲霉野生型和ΔsodC中 SOD家族编码基因对甲萘醌胁迫的应激响应
4.4 本章小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
【参考文献】：
硕士论文
[1]石榴腐烂病害综合防治技术研究及病原菌的分离鉴定[D]. 付娟妮.西北农林科技大学 2005
本文编号：3643966
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3643966.html
