OsTRM13基因对tRNA中Am核苷修饰的功能研究
发布时间：2022-04-22 23:09
tRNA中存在着大量的转录后修饰,这些修饰是由四种基础核苷Uridine、Cytidine、Guanosine和Adenosine衍化而来。它们的存在对tRNA的结构和功能有很大的影响,其中碱基或核糖的甲基化是最常见的转录后修饰,甲基化大多是由甲基转移酶（methyltransferase,或MTase）催化完成。甲基化修饰及相关甲基转移酶的功能已经在酵母和人类基因中得到了大量研究,但是在高等植物中相关的研究却少之又少,因此我们在本文中通过遗传学、植物生理学及蛋白体外生化等研究方法,试图研究tRNA甲基化修饰对水稻生长发育及逆境耐受的影响。本论文主要阐述了水稻tRNA-Am核苷修饰基因OsTRM13的相关功能研究。根据实验室前期研究结果:OsTRM13基因可以将酵母Am缺失突变体菌株中的Am修饰成功补回,且体外原核诱导的OsTRM13蛋白可以催化酵母tRNAGlyGCC第四位碱基C/A形成Cm/Am修饰,证明OsTRM13与酵母TRM13有类似的利用tRNA底物合成Am甲基化核苷的功能;OsTRM13基因的超表达材料和RNAi材料的研究表明OsTRM13基因的表达...
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviations)
1 综述
1.1 tRNA概述
1.1.1 tRNA的结构
1.1.2 tRNA的功能
1.2 tRNA上的修饰核苷
1.2.1 tRNA核苷甲基化酶
1.2.2 tRNA核苷甲基化修饰
1.2.3 2’-O-甲基化修饰
1.3 本研究的目的与意义
2 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 实验菌株载体
2.1.3 主要实验仪器
2.1.4 主要实验试剂
2.2 水稻种植
2.3 CTAB法提取植物组织DNA
2.4 试剂盒微量提取tRNA(OMEGA miRNA kit)
2.5 LC-MS分析核苷修饰
2.5.1 样品准备
2.5.2 LC-MS体系
2.6 目的基因的克隆和载体构建
2.6.1 引物设计
2.6.2 PCR扩增目的基因
2.6.3 PCR产物回收
2.6.4 PCR产物连pBLUE-T载体
2.6.5 CaCl_2法制大肠杆菌感受态细胞
2.6.6 连接产物转大肠杆菌感受态细胞(热激法)
2.6.7 阳性菌落的PCR鉴定
2.6.8 大肠杆菌质粒DNA的提取
2.6.9 质粒DNA的测序和序列比对分析
2.6.10 基因和表达载体酶切回收
2.6.11 目的片段与表达载体连接
2.6.12 CaCl_2法制农杆菌感受态细胞
2.6.13 农杆菌感受态细胞的转化
2.7 水稻转基材料获得:农杆菌侵染植物愈伤组织的方法
2.7.1 培养基中试剂母液配方
2.7.2 愈伤诱导
2.7.3 愈伤继代
2.7.4 愈伤与农杆菌共培养
2.7.5 选择培养
2.7.6 分化培养
2.7.7 生根培养
2.8 tRNA体外甲基化酶活测定
2.8.1 OsTRM13.GST原核表达载体
2.8.2 目标蛋白诱导表达
2.8.3 T7体外转录tRNA底物
2.8.4 tRNA体外甲基化反应
2.9 OsTRM13pmt::GUS载体构建及GUS组织染色
2.9.1 OsTRM13pmt::GUS载体构建
2.9.2 GUS组织染色
2.10 OsTRM13 CRSPR突变体植物互补载体构建
2.11 水稻花粉活力检测(I_2-KI染色法)
2.12 植物转录组测序
2.12.1 实验流程
2.12.2 转录组分析流程
3 结果与分析
3.1 OsTRM13 基因CRISPR材料表型观察
3.2 OsTRM13 基因CRISPR材料花粉活性检测
3.3 OsTRM13 CRISPR材料核苷修饰检测
3.4 OsTRM13 蛋白体外诱导及水稻内源底物的tRNA体外甲基化
3.5 OsTRM13 CRISPR纯合突变体材料与野生型的转录组比较分析
3.6 OsTRM13基因的组织特异性表达分析
4 讨论与展望
5 论文数据说明
参考文献
附录
附录 Ⅰ:常用试剂配方
附录 Ⅱ:OsTRM13 基因启动子序列
附录 Ⅲ:OsTRM13 蛋白及基因序列
附录 Ⅳ:实验中用到的引物序列
附录 Ⅴ:转录组学分析GO富集结果和KEGG富集结果
附录 Ⅵ:攻读硕士期间发表的论文
附录 Ⅶ:个人简历
致谢
本文编号：3646858
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviations)
1 综述
1.1 tRNA概述
1.1.1 tRNA的结构
1.1.2 tRNA的功能
1.2 tRNA上的修饰核苷
1.2.1 tRNA核苷甲基化酶
1.2.2 tRNA核苷甲基化修饰
1.2.3 2’-O-甲基化修饰
1.3 本研究的目的与意义
2 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 实验菌株载体
2.1.3 主要实验仪器
2.1.4 主要实验试剂
2.2 水稻种植
2.3 CTAB法提取植物组织DNA
2.4 试剂盒微量提取tRNA(OMEGA miRNA kit)
2.5 LC-MS分析核苷修饰
2.5.1 样品准备
2.5.2 LC-MS体系
2.6 目的基因的克隆和载体构建
2.6.1 引物设计
2.6.2 PCR扩增目的基因
2.6.3 PCR产物回收
2.6.4 PCR产物连pBLUE-T载体
2.6.5 CaCl_2法制大肠杆菌感受态细胞
2.6.6 连接产物转大肠杆菌感受态细胞(热激法)
2.6.7 阳性菌落的PCR鉴定
2.6.8 大肠杆菌质粒DNA的提取
2.6.9 质粒DNA的测序和序列比对分析
2.6.10 基因和表达载体酶切回收
2.6.11 目的片段与表达载体连接
2.6.12 CaCl_2法制农杆菌感受态细胞
2.6.13 农杆菌感受态细胞的转化
2.7 水稻转基材料获得:农杆菌侵染植物愈伤组织的方法
2.7.1 培养基中试剂母液配方
2.7.2 愈伤诱导
2.7.3 愈伤继代
2.7.4 愈伤与农杆菌共培养
2.7.5 选择培养
2.7.6 分化培养
2.7.7 生根培养
2.8 tRNA体外甲基化酶活测定
2.8.1 OsTRM13.GST原核表达载体
2.8.2 目标蛋白诱导表达
2.8.3 T7体外转录tRNA底物
2.8.4 tRNA体外甲基化反应
2.9 OsTRM13pmt::GUS载体构建及GUS组织染色
2.9.1 OsTRM13pmt::GUS载体构建
2.9.2 GUS组织染色
2.10 OsTRM13 CRSPR突变体植物互补载体构建
2.11 水稻花粉活力检测(I_2-KI染色法)
2.12 植物转录组测序
2.12.1 实验流程
2.12.2 转录组分析流程
3 结果与分析
3.1 OsTRM13 基因CRISPR材料表型观察
3.2 OsTRM13 基因CRISPR材料花粉活性检测
3.3 OsTRM13 CRISPR材料核苷修饰检测
3.4 OsTRM13 蛋白体外诱导及水稻内源底物的tRNA体外甲基化
3.5 OsTRM13 CRISPR纯合突变体材料与野生型的转录组比较分析
3.6 OsTRM13基因的组织特异性表达分析
4 讨论与展望
5 论文数据说明
参考文献
附录
附录 Ⅰ:常用试剂配方
附录 Ⅱ:OsTRM13 基因启动子序列
附录 Ⅲ:OsTRM13 蛋白及基因序列
附录 Ⅳ:实验中用到的引物序列
附录 Ⅴ:转录组学分析GO富集结果和KEGG富集结果
附录 Ⅵ:攻读硕士期间发表的论文
附录 Ⅶ:个人简历
致谢
本文编号：3646858
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3646858.html
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