GC376抑制α属动物冠状病毒复制的分子机制研究
发布时间：2023-04-22 10:26
冠状病毒是一类对人类和动物均造成严重危害的病原体,对世界各国的经济发展、农业发展、公共卫生安全等均造成严重危害,其中猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)对动物健康构成了严重威胁,二者均为α属冠状病毒。猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的致死率极高,尤其免疫功能尚未完善的仔猪,其死亡率为100%。目前,该病的防控主要依靠疫苗,但是在临床上不能提供100%保护,并且尚无可对该病进行有效防控与治疗的特效药物。猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是目前危害猫科动物健康的重要疾病之一,传染性高且致死率为100%。临床治疗中3C样蛋白酶(3C-like protease,3CLpro)抑制剂GC376得到了广泛使用,目前该抑制剂在治疗前期取得了较好疗效,但停药后发现存在复发现象,影响治疗的效果,降低治愈率。本研究首次证明3CL
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
1 文献综述
1.1 冠状病毒3CLpro
1.1.1 冠状病毒概述
1.1.2 冠状病毒基因组学及复制过程
1.1.3 冠状病毒3CLpro相关进展
1.1.4 3CLpro抑制剂研究进展
1.2 猪流行性腹泻研究进展
1.2.1 猪流行性腹泻概述
1.2.2 猪流行性腹泻病毒3CLpro研究进展
1.2.3 猪流行性腹泻的防治措施
1.3 猫传染性腹膜炎研究进展
1.3.1 猫传染性腹膜炎概述
1.3.2 猫传染性腹膜炎的治疗
2 目的与意义
3 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 毒株、菌株、细胞与载体
3.1.2 主要试剂与药品
3.1.3 主要仪器与设备
3.1.4 主要试剂的配制
3.1.5 生物学软件及数据库
3.1.6 实验所用引物
3.1.7 实验所用荧光多肽底物
3.2 实验方法
3.2.1 细胞传代培养
3.2.2 病毒毒价的测定(TCID50)
3.2.3 PEDV病毒的扩增
3.2.4 抑制剂GC376对病毒抑制效果评定
3.2.5 PEDV3CLpro的表达与纯化
3.2.6 FRET测定不同荧光底物的特异性
3.2.7 分子对接模拟PEDV3CLpro与GC376 的结合
3.2.8 FIPV耐药毒株的蚀斑纯化
3.2.9 RNA的提取与逆转录反应
3.2.10 FIPV耐药毒株全基因组PCR扩增与突变位点分析
4 结果分析
4.1 PEDV3CLpro的表达与纯化
4.1.1 质粒构建
4.1.2 3CLpro的大量表达纯化
4.2 抑制剂GC376对PEDV的抑制效果
4.2.1 抑制剂GC376对PEDV3CLpro的IC50
4.2.2 抑制剂GC376 在细胞培养中PEDV流行毒株的抑制效果
4.2.3 Western blot检测GC376对PEDV的抑制效果
4.2.4 IFA法检测GC376对PEDV的抑制效果
4.3 模拟PEDV3CLpro与抑制剂GC376 的结合模式
4.4 PEDV3CLpro的底物特异性
4.5 抑制剂GC376的优化
4.6 确定FIPV药物压力下的传代方法
4.7 50代FIPV的毒价与耐药性变化
4.8 通过蚀斑纯化法获得耐药性毒株
4.9 抑制剂GC376 对野生型FIPV与耐药毒株的抑制效果
4.9.1 抑制剂GC376 细胞培养中对野生型FIPV与耐药毒株的抑制效果
4.9.2 IFA法检测GC376 对野生型FIPV与耐药毒株的抑制效果
4.9.3 Western Blot检测GC376 对野生型FIPV与耐药毒株的抑制效果
4.10 耐药性毒株突变位点的分析
5 讨论
5.1 抑制剂GC376对PEDV的有效抑制作用
5.2 抑制剂GC376对其他冠状病毒的抑制效果
5.3 关于抑制剂GC376的优化方向
5.4 冠状病毒对抑制剂GC376产生耐药性的分子机制
5.5 抑制剂GC376作为新型冠状病毒候选药物的潜力
5.6 后续可开展的研究工作
6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3797459
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
1 文献综述
1.1 冠状病毒3CLpro
1.1.2 冠状病毒基因组学及复制过程
1.1.3 冠状病毒3CLpro相关进展
1.1.4 3CLpro抑制剂研究进展
1.2 猪流行性腹泻研究进展
1.2.1 猪流行性腹泻概述
1.2.2 猪流行性腹泻病毒3CLpro研究进展
1.2.3 猪流行性腹泻的防治措施
1.3 猫传染性腹膜炎研究进展
1.3.1 猫传染性腹膜炎概述
1.3.2 猫传染性腹膜炎的治疗
2 目的与意义
3 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 毒株、菌株、细胞与载体
3.1.2 主要试剂与药品
3.1.3 主要仪器与设备
3.1.4 主要试剂的配制
3.1.5 生物学软件及数据库
3.1.6 实验所用引物
3.1.7 实验所用荧光多肽底物
3.2 实验方法
3.2.1 细胞传代培养
3.2.2 病毒毒价的测定(TCID50)
3.2.3 PEDV病毒的扩增
3.2.4 抑制剂GC376对病毒抑制效果评定
3.2.5 PEDV3CLpro的表达与纯化
3.2.6 FRET测定不同荧光底物的特异性
3.2.7 分子对接模拟PEDV3CLpro与GC376 的结合
3.2.8 FIPV耐药毒株的蚀斑纯化
3.2.9 RNA的提取与逆转录反应
3.2.10 FIPV耐药毒株全基因组PCR扩增与突变位点分析
4 结果分析
4.1 PEDV3CLpro的表达与纯化
4.1.1 质粒构建
4.1.2 3CLpro的大量表达纯化
4.2 抑制剂GC376对PEDV的抑制效果
4.2.1 抑制剂GC376对PEDV3CLpro的IC50
4.2.2 抑制剂GC376 在细胞培养中PEDV流行毒株的抑制效果
4.2.3 Western blot检测GC376对PEDV的抑制效果
4.2.4 IFA法检测GC376对PEDV的抑制效果
4.3 模拟PEDV3CLpro与抑制剂GC376 的结合模式
4.4 PEDV3CLpro的底物特异性
4.5 抑制剂GC376的优化
4.6 确定FIPV药物压力下的传代方法
4.7 50代FIPV的毒价与耐药性变化
4.8 通过蚀斑纯化法获得耐药性毒株
4.9 抑制剂GC376 对野生型FIPV与耐药毒株的抑制效果
4.9.1 抑制剂GC376 细胞培养中对野生型FIPV与耐药毒株的抑制效果
4.9.2 IFA法检测GC376 对野生型FIPV与耐药毒株的抑制效果
4.9.3 Western Blot检测GC376 对野生型FIPV与耐药毒株的抑制效果
4.10 耐药性毒株突变位点的分析
5 讨论
5.1 抑制剂GC376对PEDV的有效抑制作用
5.2 抑制剂GC376对其他冠状病毒的抑制效果
5.3 关于抑制剂GC376的优化方向
5.4 冠状病毒对抑制剂GC376产生耐药性的分子机制
5.5 抑制剂GC376作为新型冠状病毒候选药物的潜力
5.6 后续可开展的研究工作
6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3797459
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3797459.html
教材专著
