酶切基因组构建CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除文库及验证
发布时间：2023-11-30 19:15
基因编辑作为生物工程中重要技术之一,在基础研究、临床治疗、遗传育种、生态多样性等方面得到广泛的应用。新型人工核酸内切酶CRISPR/Cas9系统的出现,大大提高了基因编辑的效率。CRISPR/Cas9系统在基因功能缺失方面表现出高效、精准的编辑作用。同时CRISPR/Cas9系统应用过程中的易操作性、低成本性等优势,也使得CRISPR/Cas9系统可以作为基因敲除文库的基础技术,支撑全基因组高通量的筛选工作。目前,依赖人工设计、合成guide RNA并构建guide RNA文库的建库策略,已实现小鼠、人等物种的基因组敲除文库的构建。然而大规模高通量合成过程中,人工操作与成本是不可忽略的。同时guide RNA设计受到物种基因组注释程度的严重制约,对于注释程度低的物种,所设计的基因组范围的guide RNA覆盖度大受影响。设计一个高效、非合成的高覆盖度guide RNA文库的建库策略,对于CRISPR/Cas9系统介导的敲除文库的构建至关重要。目前已有报道关于利用酶处理方式进行文库构建的建库策略,但研究中仍存在一些问题尚待解决,包括敲除文库搭载体系、guide RNA片段来源、筛选应用局...
【文章页数】：134 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 引言
1.1 CRISPR/Cas9 系统
1.1.1 CRISPR系统的发现
1.1.2 CRISPR系统的结构
1.1.3 CRISPR系统的类型
1.1.4 CRISPR系统的作用机制
1.2 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑
1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑原理
1.2.2 CRISPR/Cas9 系统与哺乳动物基因编辑
1.2.3 多途径介导的CRISPR/Cas9 系统的应用
1.2.4 Cas9 变体及其应用
1.2.5 CRISPR/Cas9 系统与传统基因编辑技术的比较
1.2.6 CRISPR/Cas9 系统应用的局限性
1.3 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库及应用
1.3.1 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库
1.3.2 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库构建策略
1.3.3 传统CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库构建方法的局限性
1.4 非合成策略构建基因组敲除文库
1.4.1 酶处理策略构建基因组敲除文库
1.4.2 随机断裂处理策略构建基因组敲除文库
1.4.3 非合成策略构建敲除文库的优势
1.4.4 非合成策略构建敲除文库的待优化条件
1.5 酶处理策略的相关限制性内切酶
1.5.1 TypeIIS型限制性内切酶及其应用
1.5.2 限制性内切酶MspI及其应用
1.6 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 限制性内切酶
2.1.4 主要试剂及试剂盒
2.1.5 常用试剂配制
2.1.6 主要生物信息分析软件及网站
2.2 实验方法
2.2.1 常规分子实验方法
2.2.2 常规细胞实验方法
2.2.3 酶切-三级文库策略构建敲除文库方法
2.2.4 检测分析
2.2.5 高通量测序数据分析
3 结果与分析
3.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因敲除效率验证
3.1.1 PKpG细胞系的获得及特征鉴定
3.1.2 针对EGFP的 guide RNA设计及载体构建
3.1.3 EGFP基因敲除效率验证流程及效率检测
3.1.4 短guide RNA对 EGFP基因敲除效率的影响
3.2 酶处理策略构建CRISPR/Cas9 敲除文库的探索与优化
3.2.1 酶切-接头法的敲除文库构建策略及建库初探
3.2.2 限制性内切酶MmeI的反应条件
3.2.3 酶切-三级文库法的敲除文库构建策略探索与优化
3.3 酶切-三级文库法构建敲除文库——以pEGFP-C1 质粒为例
3.3.1 敲除文库构建流程
3.3.2 一级文库f.MspI文库的构建及检测
3.3.3 二级文库PAM-F文库的构建及检测
3.3.4 三级文库lenti文库的构建及检测
3.3.5 针对pEGFP-C1 质粒的敲除文库验证流程
3.3.6 针对pEGFP-C1 质粒的敲除文库效率的验证
3.4 酶切-三级文库法构建敲除文库——以小鼠、猪基因组为例
3.4.1 针对小鼠、猪基因组敲除文库的构建流程
3.4.2 针对小鼠、猪基因组的f.MspI文库构建
3.4.3 针对小鼠、猪基因组的PAM-F文库及lenti文库构建
4 讨论
4.1 酶切-三级文库建库策略的可行性分析
4.1.1 建库结果分析
4.1.2 建库策略的普适性分析
4.2 酶切-三级文库策略的优势
4.2.1 与合成策略比较
4.2.2 与酶处理策略相关研究比较
4.2.3 MspI介导的PAM定位优势
4.3 酶切-三级文库策略的不足
4.3.1 MspI识别位点的局限性
4.3.2 对非编码区的敲除效率
4.4 展望
4.4.1 敲除文库的筛选应用
4.4.2 待优化的建库策略
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文
本文编号：3869066
【文章页数】：134 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 引言
1.1 CRISPR/Cas9 系统
1.1.1 CRISPR系统的发现
1.1.2 CRISPR系统的结构
1.1.3 CRISPR系统的类型
1.1.4 CRISPR系统的作用机制
1.2 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑
1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑原理
1.2.2 CRISPR/Cas9 系统与哺乳动物基因编辑
1.2.3 多途径介导的CRISPR/Cas9 系统的应用
1.2.4 Cas9 变体及其应用
1.2.5 CRISPR/Cas9 系统与传统基因编辑技术的比较
1.2.6 CRISPR/Cas9 系统应用的局限性
1.3 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库及应用
1.3.1 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库
1.3.2 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库构建策略
1.3.3 传统CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库构建方法的局限性
1.4 非合成策略构建基因组敲除文库
1.4.1 酶处理策略构建基因组敲除文库
1.4.2 随机断裂处理策略构建基因组敲除文库
1.4.3 非合成策略构建敲除文库的优势
1.4.4 非合成策略构建敲除文库的待优化条件
1.5 酶处理策略的相关限制性内切酶
1.5.1 TypeIIS型限制性内切酶及其应用
1.5.2 限制性内切酶MspI及其应用
1.6 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 限制性内切酶
2.1.4 主要试剂及试剂盒
2.1.5 常用试剂配制
2.1.6 主要生物信息分析软件及网站
2.2 实验方法
2.2.1 常规分子实验方法
2.2.2 常规细胞实验方法
2.2.3 酶切-三级文库策略构建敲除文库方法
2.2.4 检测分析
2.2.5 高通量测序数据分析
3 结果与分析
3.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因敲除效率验证
3.1.1 PKpG细胞系的获得及特征鉴定
3.1.2 针对EGFP的 guide RNA设计及载体构建
3.1.3 EGFP基因敲除效率验证流程及效率检测
3.1.4 短guide RNA对 EGFP基因敲除效率的影响
3.2 酶处理策略构建CRISPR/Cas9 敲除文库的探索与优化
3.2.1 酶切-接头法的敲除文库构建策略及建库初探
3.2.2 限制性内切酶MmeI的反应条件
3.2.3 酶切-三级文库法的敲除文库构建策略探索与优化
3.3 酶切-三级文库法构建敲除文库——以pEGFP-C1 质粒为例
3.3.1 敲除文库构建流程
3.3.2 一级文库f.MspI文库的构建及检测
3.3.3 二级文库PAM-F文库的构建及检测
3.3.4 三级文库lenti文库的构建及检测
3.3.5 针对pEGFP-C1 质粒的敲除文库验证流程
3.3.6 针对pEGFP-C1 质粒的敲除文库效率的验证
3.4 酶切-三级文库法构建敲除文库——以小鼠、猪基因组为例
3.4.1 针对小鼠、猪基因组敲除文库的构建流程
3.4.2 针对小鼠、猪基因组的f.MspI文库构建
3.4.3 针对小鼠、猪基因组的PAM-F文库及lenti文库构建
4 讨论
4.1 酶切-三级文库建库策略的可行性分析
4.1.1 建库结果分析
4.1.2 建库策略的普适性分析
4.2 酶切-三级文库策略的优势
4.2.1 与合成策略比较
4.2.2 与酶处理策略相关研究比较
4.2.3 MspI介导的PAM定位优势
4.3 酶切-三级文库策略的不足
4.3.1 MspI识别位点的局限性
4.3.2 对非编码区的敲除效率
4.4 展望
4.4.1 敲除文库的筛选应用
4.4.2 待优化的建库策略
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文
本文编号：3869066
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3869066.html