BsPif1解旋酶作用于G-四链体DNA的特异性位点研究
发布时间：2023-11-30 19:16
解旋酶是一类以ATP依赖的方式来催化破坏DNA或RNA之间的氢键的分子马达蛋白,参与细胞内多种代谢过程。Pif1解旋酶是广泛存在于病毒、原核和真核生物中的5’-3’方向解旋的SF1B解旋酶成员,近年来关于Pif1解旋酶的研究成果逐渐增多,得到了很多结构方面的数据,为理解Pif1解旋酶的工作机理和生物学功能提供了很多依据。2016年本实验室Chen et al.发表来自物种Bacteroides spp的Pif1解旋酶的BsPif1-AMPPNP,BsPif1-ADP,BsPif1-ADP-AlF3-ssDNA复合体三级晶体结构,建立了BsPif1-dsDNA复合体结构模型并提出BsPif1解旋dsDNA的工作机理。但是BsPif1作为一种特异性的G-四链体DNA(G4 DNA)解旋酶,它是如何解开G4 DNA,解旋G4 DNA的区域在何处,与G4 DNA相互作用的特异性位点有哪些,这些信息都是未知的。故我们对BsPif1继续进行深入研究,期望能够得到BsPif1与G4 DNA的复合体结构,深入研究BsPif1与G4 DNA之间的相互作用,找到BsPif1与G4 D...
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1 解旋酶
1.1.1 解旋酶概述
1.1.2 解旋酶的分类
1.2 Pif1 解旋酶及其研究进展
1.2.1 Pif1 解旋酶研究进展
1.2.2 BsPif1 解旋酶研究进展
1.3 G4 DNA概述
1.4 解旋酶的研究方法
1.4.1 电泳迁移凝胶阻滞(EMSA)
1.4.2 荧光各向异性(Fluorescence Anisotropy,FA)
1.4.3 快速停留荧光共振能量转移技术(stopped-flow FRET)
1.4.4 单分子荧光共振能量转移技术(smFRET)
1.5 本研究的目的与意义
第二章 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体结晶实验
2.1 实验材料、仪器、试剂
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验仪器
2.1.3 实验试剂
2.2 实验方法
2.2.1 BsPif1 解旋酶蛋白的表达纯化
2.2.2 核酸底物的制备
2.2.3 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的检测
2.2.4 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的结晶
2.3 实验结果
2.3.1 BsPif1 解旋酶蛋白的表达纯化结果
2.3.2 核酸底物的制备结果
2.3.3 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的检测
2.3.4 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/ds DNA的晶体初筛结果
2.4 讨论
第三章 BsPif1 解旋酶与G4 DNA互作的特异性位点研究
3.1 实验材料、仪器、试剂
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验仪器
3.1.3 实验试剂
3.2 实验方法
3.2.1 BsPif1 解旋酶特异性突变位点的设计
3.2.2 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的载体构建与表达纯化
3.2.3 核酸底物的制备
3.2.4 荧光各向异性法测定BsPif1 位点突变对DNA结合亲和力的影响
3.2.5 Stopped-flow FRET测定BsPif1 位点对DNA解旋活性的影响
3.2.6 smFRET测定BsPif1 位点突变对DNA解旋活性的影响
3.3 实验结果
3.3.1 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的载体构建结果
3.3.2 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的表达纯化结果
3.3.3 核酸底物的制备结果
3.3.4 荧光各向异性法分析BsPif1 位点突变对DNA结合亲和力的影响
3.3.5 Stopped-flow FRET分析BsPif1 位点突变对解旋G4 DNA活性的影响
3.3.6 smFRET分析BsPif1 位点突变对解旋G4 DNA活性的影响
3.4 讨论
讨论与展望
附录
参考文献
致谢
个人简历
本文编号：3869067
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1 解旋酶
1.1.1 解旋酶概述
1.1.2 解旋酶的分类
1.2 Pif1 解旋酶及其研究进展
1.2.1 Pif1 解旋酶研究进展
1.2.2 BsPif1 解旋酶研究进展
1.3 G4 DNA概述
1.4 解旋酶的研究方法
1.4.1 电泳迁移凝胶阻滞(EMSA)
1.4.2 荧光各向异性(Fluorescence Anisotropy,FA)
1.4.3 快速停留荧光共振能量转移技术(stopped-flow FRET)
1.4.4 单分子荧光共振能量转移技术(smFRET)
1.5 本研究的目的与意义
第二章 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体结晶实验
2.1 实验材料、仪器、试剂
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验仪器
2.1.3 实验试剂
2.2 实验方法
2.2.1 BsPif1 解旋酶蛋白的表达纯化
2.2.2 核酸底物的制备
2.2.3 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的检测
2.2.4 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的结晶
2.3 实验结果
2.3.1 BsPif1 解旋酶蛋白的表达纯化结果
2.3.2 核酸底物的制备结果
2.3.3 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/dsDNA复合体的检测
2.3.4 BsPif1 解旋酶与G4 DNA/ds DNA的晶体初筛结果
2.4 讨论
第三章 BsPif1 解旋酶与G4 DNA互作的特异性位点研究
3.1 实验材料、仪器、试剂
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验仪器
3.1.3 实验试剂
3.2 实验方法
3.2.1 BsPif1 解旋酶特异性突变位点的设计
3.2.2 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的载体构建与表达纯化
3.2.3 核酸底物的制备
3.2.4 荧光各向异性法测定BsPif1 位点突变对DNA结合亲和力的影响
3.2.5 Stopped-flow FRET测定BsPif1 位点对DNA解旋活性的影响
3.2.6 smFRET测定BsPif1 位点突变对DNA解旋活性的影响
3.3 实验结果
3.3.1 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的载体构建结果
3.3.2 BsPif1 解旋酶突变体蛋白的表达纯化结果
3.3.3 核酸底物的制备结果
3.3.4 荧光各向异性法分析BsPif1 位点突变对DNA结合亲和力的影响
3.3.5 Stopped-flow FRET分析BsPif1 位点突变对解旋G4 DNA活性的影响
3.3.6 smFRET分析BsPif1 位点突变对解旋G4 DNA活性的影响
3.4 讨论
讨论与展望
附录
参考文献
致谢
个人简历
本文编号：3869067
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