硫化物应激下单环刺螠MAPK信号通路的功能初探

发布时间：2016-11-05 11:21

  本文关键词：硫化物应激下单环刺螠MAPK信号通路的功能初探，由笔耕文化传播整理发布。

《中国海洋大学》 2015年

硫化物应激下单环刺螠MAPK信号通路的功能初探

刘树人  

【摘要】：p38和ERK是MAPK信号通路中三条主要亚通路的关键分子,在生物体内参与多种生命进程,如细胞增殖、分化、黏附、存活、死亡、代谢以及应对多种环境应激等。目前大多数的相关研究都聚焦于哺乳动物,并且在体外培养细胞中开展研究。海洋无脊椎动物种类繁多,具有多样的生理特征和生存环境,开展MAPK通路在低等动物中的相关研究,将有助于人们系统认知这些通路的生物学功能以及阐述其在动物适应环境中的作用。单环刺螠(Urechis unicinctus)是一种栖息于沿岸底质“U”形管道内的螠虫动物,在退潮期间其洞穴内的硫化物浓度通常明显提高。之前的研究表明单环刺螠可以耐受这种硫化物的暴露,并且已在细胞学特征、代谢产物以及关键酶的作用等方面对这种现象进行了解析。本文定位于MAPK信号通路,尝试研究其在单环刺螠耐受硫化物过程中的作用,以期确定单环刺螠组织细胞中参与应对硫化物的关键MAPK亚通路,为揭示单环刺螠耐受硫化物的分子机制提供科学数据。本研究取得的主要结果如下：采用RACE技术获得了单环刺螠MAPK通路3个亚通路中的关键分子JNK、 p38和ERK的cDNA序列,其中JNKcDNA序列全长为2102 bp,编码403个氨基酸；p38 cDNA序列全长为2772 bp,编码363个氨基酸；ERK cDNA部分序列长度为507 bp,可编码169个氨基酸。将JNK、p38的ORF(开放阅读框,open reading frame)全长序列与pET28a载体连接构建重组表达质粒,体外成功表达了包涵体形式的JNK、p38重组蛋白并获得纯度大于85%的纯化蛋白,制备了它们的多克隆抗体。使用本次获得JNK、p38多克隆抗体以及商业购买的ERK多克隆体和3种蛋白的磷酸化单克隆抗体,采用Western blot技术研究了单环刺螠暴露在50μM和150 μM硫化物环境下,其呼吸肠细胞中上述3个关键分子总蛋白(非磷酸化蛋白,未活化型蛋白)含量和磷酸化蛋白(活化型蛋白)含量的变化,结果显示：当单环刺螠暴露于硫化物环境中时,其呼吸肠细胞中磷酸化JNK的含量呈现显著性地持续升高趋势,其起始显著升高发生在单环刺螠暴露0.5 h,随着暴露时间的延长,磷酸化JNK的含量持续升高,并在150μM硫化物暴露48 h时其含量增至最高,为对照组的10.2倍；此外,暴露于50μM硫化物中的单环刺螠呼吸肠磷酸化JNK含量普遍低于150μM硫化物相同暴露时间的磷酸化JNK的含量。单环刺螠呼吸肠中磷酸化ERK的含量在硫化物暴露0.25 h-1 h期间呈现瞬时显著增高的特点,之后其表达量与对照组以及不同浓度硫化物组间均无显著性差异;单环刺螠呼吸肠中磷酸化p38的含量在整个硫化物暴露期间未见显著性变化。单环刺螠硫化物暴露期间,JNK、p38在呼吸肠中的总蛋白含量均未见显著性变化,除了p38总蛋白含量在暴露后0.25 h时显著升高；ERK的总蛋白水平在150μM硫化物处理下呈现先降低后恢复原水平的变化,而在50μM硫化物处理组中则持续降低至原水平的35%后维持稳定状态。本研究结果表明,在MAPK通路的3个子通路中,JNK信号通路可能是单环刺螠应对硫化物暴露的关键通路,ERK信号通路或许参与了单环刺螠早期应对硫化物暴露的的过程,而p38在单环刺螠应对硫化物暴露过程中作用不明显。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q953
【目录】：

摘要5-7

Abstract7-11

第一章 前言11-26

1 MAPK信号通路简介及其主要功能11-19

1.1 MAPK信号通路简介11-12

1.2 MAPKs家族蛋白的结构及功能12-15

1.3 MAPK信号级联亚通路及其功能15-19

2 硫化物的来源和在生物体内的作用19-21

2.1 水体中外源硫化物的来源以及对生物的毒性19-20

2.2 内源硫化物的合成和代谢以及其作用20-21

3 硫化氢与MAPK信号通路21-22

4 单环刺螠生物学特征及其耐受硫化物的研究进展22-24

4.1 单环刺螠生物学特征22-23

4.2 单环刺螠硫化物耐受机制的相关研究23-24

5 论文研究意义24-26

第二章 单环刺螠MAPKs信号通路关键因子基因的克隆与生物信息学分析26-40

1 材料与方法26-33

1.1 材料26-27

1.1.1 实验动物26

1.1.2 试剂盒、工具酶和引物26-27

1.2 实验方法27-33

1.2.1 单环刺螠呼吸肠总RNA的提取27-28

1.2.1.1 实验前期准备27

1.2.1.2 Trizol法提取RNA27-28

1.2.2 RACE扩增JNK和p38的全长序列28-31

1.2.3 部分ERK cDNA部分序列的获取31-32

(1) 合成第一链cDNA31-32

1.2.4 ERK、JNK、p38的生物信息学分析32-33

2 实验结果33-38

2.1 单环刺螠JNK全长cDNA序列的获得和特征分析33-35

2.2 单环刺螠p38全长cDNA序列的获得和特征分析35-36

2.3 单环刺螠ERK的序列特征分析36-38

3 讨论38-40

第三章 单环刺螠硫化物应激下MAPKs通路的反应40-57

1 实验材料及方法41-49

1.1 实验材料41-42

1.1.1 实验动物及样本制备41

1.1.2 实验材料41-42

1.2 实验方法42-49

1.2.1 单环刺螠JNK、p38原核表达载体的构建42-44

1.2.2 单环刺螠JNK和p38重组蛋白的原核表达44-45

1.2.3 重组蛋白表达条件的优化45

1.2.4 目的重组包涵体蛋白的纯化45

1.2.5 JNK和p38多克隆抗体的制备和效价检测45-46

1.2.6 多克隆抗体的特异性检测46-47

1.2.7 JNK、p38、ERK磷酸化单克隆抗体的选择及购买47

1.2.8 Western blot检测47-48

1.2.9 实验数据的处理48-49

2 实验结果49-54

2.1 目的基因体外重组蛋白的表达和纯化49-50

2.2 多克隆抗体的效价和特异性检测50-51

2.3 JNK在硫化物暴露下的单环刺螠呼吸肠细胞中被长效激活51-52

2.4 p38在单环刺螠硫化物暴露下的呼吸肠细胞中表达量瞬间升高52-53

2.5 ERK在单环刺螠硫化物暴露下的呼吸肠细胞中被瞬时激活53-54

3 讨论54-57

3.1 JNK信号通路是单环刺螠呼吸肠应对硫化物暴露的主要MAPKs通路55

3.2 ERK的瞬时激活可能与细胞存活相关55-56

3.3 JNK和ERK信号通路之间的平衡决定细胞的命运56-57

结论57-58

参考文献58-68

致谢68-69

个人简历69

发表的学术论文69

下载全文 更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？ 欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 焦绪栋;安传锋;王福亮;唐志红;王珉;秦松;;单环刺螠废弃内脏中粗多糖的提取工艺优化[J];食品科学;2013年02期

2 马玉彬;谭志;张志峰;;单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2010年06期

3 KANG Kyoung Ho;;The Effect of Toxic Sulfide Exposure on Oxygen Consumption and Oxidation Products in Urechis unicinctus(Echiura:Urechidae)[J];Journal of Ocean University of China;2010年02期

4 马卓君;包振民;王思锋;张志峰;;Sulfide-based ATP production in Urechis unicinctus[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2010年03期

5 蒋仲青;刘万顺;韩宝芹;朱琦;;单环刺螠纤溶酶的分离纯化及溶栓活性的初步研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2009年S1期

6 赵欢;韩宝芹;刘万顺;王常红;;单环刺螠多肽抗肿瘤及对小鼠免疫功能的调节作用[J];中国天然药物;2008年04期

7 张志峰;王思锋;霍继革;邵明瑜;康庆浩;;单环刺螠对硫化物暴露的呼吸代谢适应[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2006年04期

8 Tyler ZARUBIN;Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway[J];Cell Research;2005年01期

9 邵明瑜,张志峰,康庆浩,马卓君,王开顺;单环刺螠虫消化道组织学和细胞学[J];中国水产科学;2003年04期

10 龚小卫,姜勇;丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)生物学功能的结构基础[J];中国生物化学与分子生物学报;2003年01期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 梁成刚;陈晴晴;石桃雄;陈其皎;孟子烨;陈庆富;;普通荞麦种内丝裂原活化蛋白激酶序列分析[J];华南农业大学学报;2016年04期

2 姜林宏;林雪芬;吴庆亭;汲平;;P38 MAPK在滑膜细胞表达炎性因子中的作用[J];口腔颌面修复学杂志;2016年02期

3 李涛;刘源;党胜春;张建新;;p38MAPK抑制剂对重症急性胰腺炎的保护[J];海南医学;2016年03期

4 刘树人;刘晓龙;李岳;马晓玉;张志峰;;单环刺螠呼吸肠JNK通路对硫化物的应激反应[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2016年02期

5 段亚飞;董宏标;王芸;李卓佳;张家松;;干露胁迫对日本囊对虾呼吸代谢酶活性和RNA/DNA比值的影响[J];海洋渔业;2016年01期

6 汪沛;曹志中;;骨形态发生蛋白-9诱导牙周膜干细胞成骨分化及信号通路的研究进展[J];医学研究生学报;2015年12期

7 惠宇;周峰;雷洪恩;杨璧铖;辛钟成;侯建全;;褪黑素对糖尿病性勃起功能障碍大鼠的神经保护作用及可能的机制研究[J];现代泌尿外科杂志;2016年04期

8 夏乐敏;费雪洁;;银杏叶滴丸对脑梗死病人p38活性的调控作用[J];中西医结合心脑血管病杂志;2015年16期

9 孟闪闪;李洁琼;阮梦鸽;陆雪莹;马纪;;荒漠甲虫小胸鳖甲胞外信号调节激酶ERK基因的克隆与低温表达谱分析[J];环境昆虫学报;2015年05期

10 王晗敏;姚月蓉;项敏泓;周欢明;张兴儒;;结膜松弛症手术切除标本中几种激酶的检测[J];中华眼外伤职业眼病杂志;2015年05期

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴金龙;刘华忠;师莉莎;王光;黄燕;钟杰平;潘江球;;乌贼墨多糖提取工艺优化[J];食品工业科技;2011年07期

2 初金鑫;蔡文娣;韩宝芹;刘万顺;;单环刺螠纤溶酶UFE-I的溶栓作用、溶血毒性和急性毒性[J];药物生物技术;2010年04期

3 谭志;马玉彬;邵明瑜;张志峰;;单环刺螠硫醌氧化还原酶相互作用蛋白质的筛选[J];海洋科学;2010年08期

4 马玉彬;谭志;张志峰;;单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2010年06期

5 文松松;赵峡;于广利;高英霞;;海洋动物多糖研究进展[J];中国海洋药物;2009年04期

6 孟祥欣;郭承华;董新伟;秦倩;周厚成;赵刚;;单环刺螠(Urechis unicinctus)废弃内脏营养成分分析[J];烟台大学学报(自然科学与工程版);2008年03期

7 程婷婷;李冬梅;刘娜;朱蓓薇;;一种鲍鱼脏器多糖的鉴定及活性研究[J];中国海洋药物;2008年02期

8 张彬;孙晓江;;溶栓药物的基础和临床研究的新进展[J];中国临床神经科学;2008年01期

9 陈浩凡;潘仕荣;胡瑜;石桂新;;动物多糖的分离纯化方法[J];现代食品与药品杂志;2007年03期

10 刁勇;居海亮;许瑞安;;单环刺螠抗血栓组分的分离纯化和药效学研究[J];中国生化药物杂志;2007年03期

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 霍继革;张志峰;胡晓丽;王思锋;康庆浩;;硫应激单环刺螠差异表达的初步研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2007年03期

2 蒋仲青;刘万顺;韩宝芹;朱琦;;单环刺螠纤溶酶的分离纯化及溶栓活性的初步研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2009年S1期

3 王雷;刘海梅;彭鸽;车长远;贡汉生;张正茂;;单环刺螠营养成分及体内活性物质的研究进展[J];鲁东大学学报(自然科学版);2011年04期

4 李诺,宋淑莲,唐永政;单环刺螠[J];生物学通报;1998年08期

5 韩宝芹;冯伊琳;毕庆庆;刘万顺;隋正红;杨官品;;单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2011年Z2期

6 李诺,宋淑莲,唐永政,孟瑞萍,王宝钢;单环刺螠体壁氨基酸组分与含量的分析[J];齐鲁渔业;2000年05期

7 李诺,宋淑莲,唐永政,王宝钢;单环刺螠增养殖生物学的研究[J];齐鲁渔业;1998年01期

8 李金龙;秦贞奎;史晓丽;张志峰;;铜离子对单环刺螠的毒性及对体壁抗氧化酶活性的影响[J];海洋湖沼通报;2012年02期

9 邵明瑜,张志峰,康庆浩,马卓君,王开顺;单环刺螠虫消化道组织学和细胞学[J];中国水产科学;2003年04期

10 韩宝芹;杜芳;毕庆庆;杨艳;刘伟治;刘万顺;;单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因克隆及原核表达[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2014年03期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 唐永政;陈娴;彭安;梁前进;何大澄;王永潮;;单环刺螠(Unechis unicinctus)雌雄生殖细胞及早期发育中centrin、CENP-G及HR_(6B)基因的表达及功能的探讨[A];中国动物学会全国显微与亚显微形态科学（细胞及分子显微技术科学）分会第十一次学术研讨会论文摘要集[C];2002年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 史晓丽;单环刺螠硫代谢相关基因的筛选及硫醌氧化还原酶的转录调控初探[D];中国海洋大学;2012年

2 毕庆庆;单环刺螠纤溶酶的分离纯化及单环刺螠纤溶酶Ⅲ的药效学研究[D];中国海洋大学;2013年

3 马玉彬;单环刺螠（Urechis unicinctus）硫醌氧化还原酶的研究[D];中国海洋大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 刘树人;硫化物应激下单环刺螠MAPK信号通路的功能初探[D];中国海洋大学;2015年

2 孙雪燕;单环刺螠纤溶酶的重组表达及活性研究[D];中国海洋大学;2015年

3 李金龙;单环刺螠（Urechis unicinctus）交替氧化酶基因的克隆及其诱导表达[D];中国海洋大学;2011年

4 曲卫光;潍坊滨海区北部海域单环刺螠水产资源保护的研究[D];中国农业科学院;2011年

5 任志强;单环刺螠（Urechis unicinctus）交替氧化酶对硫化物应激的适应性反应[D];中国海洋大学;2014年

6 马卓君;单环刺螠Urechis unicinctus硫化物耐受机理初探[D];中国海洋大学;2003年

7 杜芳;单环刺螠纤溶酶Ⅲ的基因克隆及表达[D];中国海洋大学;2013年

8 冯伊琳;单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因的克隆及其在酵母中的表达[D];中国海洋大学;2011年

9 王思锋;单环刺螠（Urechis unicinctus）对硫化物的氧化解毒及代谢适应[D];中国海洋大学;2006年

10 郭金明;单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的分离纯化和性质研究[D];中国海洋大学;2008年

  本文关键词：硫化物应激下单环刺螠MAPK信号通路的功能初探，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：165126