果胶甲酯酶基因PME21调节拟南芥花粉发育及花粉管生长的研究

发布时间：2023-04-09 20:35

　　被子植物通过花粉管的生长将两个精子细胞运送到胚囊中,与卵细胞和中央细胞融合形成受精卵和胚乳,完成双受精过程。因此,花粉管的生长对于植物完成双受精是至关重要的。胞吐和内吞在维持花粉管的生长过程中起到重要作用。果胶甲酯酶(PME)使高甲酯化的果胶质去甲酯化,形成的低甲酯化果胶质与Ca²⁺交联,从而维持花粉管硬度,在花粉发育和花粉管生长过程中起到重要的作用。PME能够通过胞吐的方式到达花粉管前端的细胞壁从而发挥功能,而其是否会参与内吞过程却不清楚。拟南芥TML基因编码一个内吞复合体亚基,可以与货物蛋白结合。前期我们通过酵母双杂交筛选得到一个与其互作的蛋白pectin methylesterase 21(PME21)。PME21基因从12时期开始在花粉及花粉管中高量表达,这与TML在花粉/花粉管中的表达模式一致。对PME21的亚细胞定位进行观察发现,PME21分布在花粉的萌发孔以及花粉管的顶端。我们在前期的研究过程中鉴定到一个拟南芥T-DNA插入的突变体pme21-1。与TML突变体一致,pme21-1/+大约有一半的花粉形态异常。进一步观察发现花粉是从12时期开始出现活...

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 被子植物雄配子体的发育与结构
        1.1.1 花粉的发育
        1.1.2 花粉粒的结构
    1.2 花粉与雌蕊组织的相互作用
        1.2.1 花粉的粘附与识别
        1.2.2 花粉的水合与萌发
        1.2.3 花粉管的生长
            1.2.3.1 花粉管细胞壁果胶质的分布和修饰
            1.2.3.2 花粉管生长中的胞吐作用
            1.2.3.3 花粉管生长参与的内吞作用
    1.3 网格蛋白介导的内吞作用
    1.4 植物果胶甲酯酶PME
        1.4.1 果胶甲酯酶的类型
        1.4.2 果胶甲酯酶的结构
        1.4.3 果胶甲酯酶活性的调控
        1.4.4 PRO区域在PME定位和功能中的作用
        1.4.5 PME调控花粉管的生长
    1.5 果胶甲酯酶抑制因子PMEI
    1.6 本实验的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验材料及培养条件
        2.1.2 菌株和质粒
        2.1.3 酶与生化试剂
            2.1.3.1 酶类
            2.1.3.2 基本生化药剂
            2.1.3.3 各种缓冲液及培养基配方
        2.1.4 实验中所使用的引物名称及序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 转基因载体构建
            2.2.1.1 PCR引物设计
            2.2.1.2 PCR扩增目的片段
            2.2.1.3 扩增产物的胶回收
            2.2.1.4 目的片段与克隆载体连接
            2.2.1.5 制备大肠杆菌感受态细胞
            2.2.1.6 大肠杆菌感受态转化
            2.2.1.7 大肠杆菌菌落PCR鉴定
            2.2.1.8 阳性菌落的测序
            2.2.1.9 质粒的提取
            2.2.1.10 质粒DNA的酶切
            2.2.1.11 目的DNA片段与载体DNA片段的连接
        2.2.2 农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化
            2.2.2.1 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备
            2.2.2.2 冻融法转化农杆菌
        2.2.3 实验材料拟南芥的种植和转化
            2.2.3.1 拟南芥的种植
            2.2.3.2 农杆菌转化拟南芥
        2.2.4 植物总DNA的提取
        2.2.5 植物总RNA的提取及反转录
        2.2.6 Real-time PCR分析
        2.2.7 GUS染色
        2.2.8 亚历山大染色
        2.2.9 苯胺蓝染色
        2.2.10 花粉果胶质染色
        2.2.11 花粉萌发实验
        2.2.12 体内诱导花粉管生长实验
        2.2.13 Aritifical miRNA突变体的构建
3 结果与分析
    3.1 PME21的组织表达模式及定位
        3.1.1 PME21的表达模式
        3.1.2 PME21的亚细胞定位
    3.2 拟南芥pme21-1/+突变体表型观察
        3.2.1 pme21-1/+突变体花粉形态异常
        3.2.2 pme21-1/+突变体花粉体外萌发异常
        3.2.3 pme21-1/+突变体花粉从12a时期出现细胞壁成分积累异常
    3.3 CRISPR/Cas9 技术创制拟南芥PME21 突变体
    3.4 PME21参与花粉管生长
        3.4.1 下调PME21的表达影响花粉管的生长
        3.4.2 PME21调控果胶质在花粉管上的分布
    3.5 PME21的分段定位
    3.6 PME21可能参与花粉管生长方向的改变
    3.7 PME21与TML互作
        3.7.1 PME21-mCherry和 TML-YFP存在共定位关系
        3.7.2 下调TML的表达会影响PME21 在花粉管中的定位
    3.8 内吞抑制剂处理影响PME21的定位
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的论文及成果



本文编号：3787692