宿主因子ZFAT沉默抑制H5N1高致病性禽流感病毒复制的分子机制

发布时间：2023-06-27 21:11

　　H5N1高致病性禽流感(HPAI)是长期以来威胁人和动物健康的人畜共患病,在季节性暴发中常常体现出跨物种传播的特性。H5N1高致病性禽流感病毒(HPAIV)在哺乳动物体内的复制依赖于病毒核糖核蛋白复合体(vRNP)所参与的一系列复杂生物学进程,而病毒非结构蛋白(NS1)则在病毒vRNP发挥功能的过程中与宿主细胞进行着广泛复杂的相互作用,为了使病毒在细胞内的复制得以顺利进行,NS1蛋白将会抑制宿主的固有免疫系统,同时强化病毒的聚合酶活性。包含AT钩结构域锌指蛋白(ZFAT)是锌指蛋白家族成员之一,具有调节造血干细胞分化及维持外周血免疫细胞稳态的功能,作为免疫相关基因的转录调节因子,至今未见其参与抗病毒免疫的报道。本文为探讨ZFAT在流感病毒感染进程中的功能与分子机制,利用规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)基因编辑技术构建ZFAT敲除细胞系A549-CRISPR-Cas9-ZFAT,通过复制滴定试验检测H5N1 HPAIV在该细胞系中的复制能力,激光共聚焦检测流感病毒感染条件下ZFAT的空间分布变化,揭示ZFAT沉默对流感病毒感染进程的影响,核质分离试验分析ZFAT沉默对流感病毒v...

【文章页数】：42 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Summary
第一章 文献综述
    1.1 H5N1 高致病性禽流感(HPAI)及其复制机制
    1.2 流感病毒非结构蛋白1(NS1)与抗病毒固有免疫
    1.3 宿主因子ZFAT与病原-宿主互作
    1.4 CRISPR-Cas9 基因编辑技术
    1.5 本研究的目的与意义
第二章 ZFAT敲除细胞系的构建与ZFAT沉默对H5N1 HPAIV复制的影响
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株及鸡胚
        2.1.2 细胞系及载体
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 Oligo序列设计与合成
    2.2 方法
        2.2.1 ZFAT敲除细胞系构建
        2.2.2 流感病毒复制滴定
        2.2.3 激光共聚焦试验(Confocal Microscopy)
        2.2.4 核质分离试验
        2.2.5 蛋白免疫印迹试验(Western Blot)
    2.3 结果
        2.3.1 ZFAT敲除效果验证
        2.3.2 敲除ZFAT抑制H5N1 HPAIV的复制
        2.3.3 ZFAT沉默延缓H5N1 HPAIV的 vRNP入核
        2.3.4 ZFAT沉默降低H5N1 HPAIV vRNP的组装效率
        2.3.5 ZFAT与 H5N1 HPAIV NP蛋白的空间分布存在重叠
    2.4 讨论
第三章 ZFAT过表达质粒的构建与病毒-宿主的相互作用
    3.1 材料
        3.1.1 细胞系及载体
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 引物设计与合成
    3.2 方法
        3.2.1 过表达载体构建与免疫共沉淀试验
        3.2.2 蛋白免疫印迹试验
        3.2.3 激光共聚焦试验
    3.3 结果
        3.3.1 AH05-NS1 蛋白K41 氨基酸位点调控与ZFAT的相互作用
        3.3.2 K41位点是AH05-NS1的核定位信号
    3.4 讨论
全文结论
参考文献
致谢
作者简介
导师简介



本文编号：3835344