家蝇2种新型抗菌肽的鉴定及功能分析
发布时间：2023-07-01 13:33
家蝇(Musca domestica)是一种世界性分布的昆虫,具有很好的环境适应能力和强大的先天免疫系统,可以携带许多病原微生物而自身不会被感染。家蝇的体内能产生多种具有杀菌和抗病毒能力的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),它们是家蝇重要的免疫效应因子。抗菌肽是宿主为抵抗病原入侵而产生的一类小分子多肽,是先天免疫的重要组成成分,具有广谱抑菌活性和不易产生耐药性的特点。目前我们对家蝇等双翅目昆虫的抗菌肽研究较为深入,例如攻击素(attacin)、天蚕素(cecropin)、双翅肽(diptericin)、防御素(defensin)和溶菌酶(lysozyme)等。新型抗菌剂的研发和分离纯化制备是目前的研究热点,例如本实验的家蝇抗菌肽muscin和domesticin,以及文献报道的AMP-17、MLH、MAF-1等。作为免疫效应因子,抗菌肽基因的表达在宿主受到病原刺激后往往呈大幅上调。我们发现家蝇转录组中多条未知基因序列在细菌感染后显著上调,结合生物信息学分析,初步推测其为新型抗菌肽。本研究对其中2条基因序列AMP-5和AMP-8所编码的蛋白进行了重组表达,并...
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 前言
1.1 家蝇的抗病能力及其启示
1.2 抗菌肽
1.3 抗菌肽的来源
1.4 抗菌肽的抑菌机制
1.4.1 作用于细胞壁靶点
1.4.2 作用于细胞膜靶点
1.4.3 作用于细胞内靶点
1.5 抗菌肽的应用
1.5.1 抗菌肽在临床上的应用
1.5.2 抗菌肽在转基因动物的应用
1.5.3 抗菌肽作为饲料添加剂的应用
1.6 毕赤酵母真核表达系统
1.6.1 宿主菌
1.6.2 表达载体
1.6.3 毕赤酵母表达系统的特点
1.7 本课题的研究目的和意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 供试材料
2.1.2 主要实验仪器和试剂
2.1.3 主要培养基和Tricine-SDS-PAGE的配制方法
2.2 实验方法
2.2.1 家蝇AMP-5和AMP-8 基因的生物信息学分析
2.2.2 家蝇总RNA提取及c DNA制备
2.2.3 抗菌肽AMP-5 基因和AMP-8 基因的扩增
2.2.4 克隆载体pMD-19T-AMP-5和pMD-19T-AMP-8 的构建及双酶切验证
2.2.5 表达载体pPIC9K-AMP-5和pPIC9K-AMP-8 的构建及双酶切验证
2.2.6 pPIC9K-AMP-5和pPIC9K-AMP-8 质粒的线性化及酵母感受态的制备
2.2.7 酵母的电击转化及高拷贝转化子的筛选
2.2.8 蛋白的表达、纯化及活性检测
2.2.9 抗菌肽AMP-5和AMP-8 抑菌谱的测定
2.2.10 抗菌肽AMP-5 和AMP-8 作用于细菌后细菌形态的扫描电镜观察
2.2.11 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的体内清除实验
2.2.12 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的溶血活性实验
第三章 实验结果
3.1 家蝇抗菌肽AMP-5 的表达及抑菌活性研究
3.1.1 AMP-5 基因序列的生物信息学分析
3.1.2 抗菌肽AMP-5 基因的扩增
3.1.3 抗菌肽克隆载体pMD-19T-AMP-5 的构建及双酶切验证
3.1.4 抗菌肽表达载体pPIC9K-AMP-5 的构建及双酶切、线性化验证
3.1.5 遗传霉素筛选pPIC9K-AMP-5 酵母的高拷贝转化子
3.1.6 抗菌肽AMP-5 的诱导表达及蛋白检测
3.1.7 抗菌肽AMP-5 的抑菌圈实验
3.1.8 抗菌肽AMP-5 的纯化
3.1.9 抗菌肽AMP-5 抑菌谱的测定
3.1.10 抗菌肽AMP-5 的体内抑菌实验
3.1.11 抗菌肽AMP-5 作用于细菌后细菌形态的扫描电镜观察
3.1.12 家蝇抗菌肽AMP-5 的溶血活性实验
3.2 家蝇抗菌肽AMP-8 的表达及抑菌活性研究
3.2.1 AMP-8 基因序列的生物信息学分析
3.2.2 抗菌肽AMP-8 基因的扩增
3.2.3 抗菌肽克隆载体pMD-19T-AMP-8 的构建及双酶切验证
3.2.4 抗菌肽表达载体pPIC9K-AMP-8 的构建及双酶切、线性化验证
3.2.5 遗传霉素筛选pPIC9K-AMP-8 酵母的高拷贝转化子
3.2.6 抗菌肽AMP-8 的诱导表达及蛋白检测
3.2.7 抗菌肽AMP-8 的抑菌圈实验
3.2.8 抗菌肽AMP-8 的纯化
3.2.9 抗菌肽AMP-8 抑菌谱的测定
3.2.10 抗菌肽AMP-8 的体内抑菌实验
3.2.11 抗菌肽AMP-8 作用于细菌后细菌形态的扫描电镜观察
3.2.12 抗菌肽AMP-8 的溶血活性实验
第四章 讨论
4.1 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的筛选
4.2 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的获取
4.3 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的抑菌活性
4.4 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的抑菌机制
4.5 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的溶血活性
4.6 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的研究展望
第五章 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间取得的科研成果
本文编号：3836336
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 前言
1.1 家蝇的抗病能力及其启示
1.2 抗菌肽
1.3 抗菌肽的来源
1.4 抗菌肽的抑菌机制
1.4.1 作用于细胞壁靶点
1.4.2 作用于细胞膜靶点
1.4.3 作用于细胞内靶点
1.5 抗菌肽的应用
1.5.1 抗菌肽在临床上的应用
1.5.2 抗菌肽在转基因动物的应用
1.5.3 抗菌肽作为饲料添加剂的应用
1.6 毕赤酵母真核表达系统
1.6.1 宿主菌
1.6.2 表达载体
1.6.3 毕赤酵母表达系统的特点
1.7 本课题的研究目的和意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 供试材料
2.1.2 主要实验仪器和试剂
2.1.3 主要培养基和Tricine-SDS-PAGE的配制方法
2.2 实验方法
2.2.1 家蝇AMP-5和AMP-8 基因的生物信息学分析
2.2.2 家蝇总RNA提取及c DNA制备
2.2.3 抗菌肽AMP-5 基因和AMP-8 基因的扩增
2.2.4 克隆载体pMD-19T-AMP-5和pMD-19T-AMP-8 的构建及双酶切验证
2.2.5 表达载体pPIC9K-AMP-5和pPIC9K-AMP-8 的构建及双酶切验证
2.2.6 pPIC9K-AMP-5和pPIC9K-AMP-8 质粒的线性化及酵母感受态的制备
2.2.7 酵母的电击转化及高拷贝转化子的筛选
2.2.8 蛋白的表达、纯化及活性检测
2.2.9 抗菌肽AMP-5和AMP-8 抑菌谱的测定
2.2.10 抗菌肽AMP-5 和AMP-8 作用于细菌后细菌形态的扫描电镜观察
2.2.11 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的体内清除实验
2.2.12 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的溶血活性实验
第三章 实验结果
3.1 家蝇抗菌肽AMP-5 的表达及抑菌活性研究
3.1.1 AMP-5 基因序列的生物信息学分析
3.1.2 抗菌肽AMP-5 基因的扩增
3.1.3 抗菌肽克隆载体pMD-19T-AMP-5 的构建及双酶切验证
3.1.4 抗菌肽表达载体pPIC9K-AMP-5 的构建及双酶切、线性化验证
3.1.5 遗传霉素筛选pPIC9K-AMP-5 酵母的高拷贝转化子
3.1.6 抗菌肽AMP-5 的诱导表达及蛋白检测
3.1.7 抗菌肽AMP-5 的抑菌圈实验
3.1.8 抗菌肽AMP-5 的纯化
3.1.9 抗菌肽AMP-5 抑菌谱的测定
3.1.10 抗菌肽AMP-5 的体内抑菌实验
3.1.11 抗菌肽AMP-5 作用于细菌后细菌形态的扫描电镜观察
3.1.12 家蝇抗菌肽AMP-5 的溶血活性实验
3.2 家蝇抗菌肽AMP-8 的表达及抑菌活性研究
3.2.1 AMP-8 基因序列的生物信息学分析
3.2.2 抗菌肽AMP-8 基因的扩增
3.2.3 抗菌肽克隆载体pMD-19T-AMP-8 的构建及双酶切验证
3.2.4 抗菌肽表达载体pPIC9K-AMP-8 的构建及双酶切、线性化验证
3.2.5 遗传霉素筛选pPIC9K-AMP-8 酵母的高拷贝转化子
3.2.6 抗菌肽AMP-8 的诱导表达及蛋白检测
3.2.7 抗菌肽AMP-8 的抑菌圈实验
3.2.8 抗菌肽AMP-8 的纯化
3.2.9 抗菌肽AMP-8 抑菌谱的测定
3.2.10 抗菌肽AMP-8 的体内抑菌实验
3.2.11 抗菌肽AMP-8 作用于细菌后细菌形态的扫描电镜观察
3.2.12 抗菌肽AMP-8 的溶血活性实验
第四章 讨论
4.1 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的筛选
4.2 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的获取
4.3 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的抑菌活性
4.4 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的抑菌机制
4.5 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的溶血活性
4.6 抗菌肽AMP-5和AMP-8 的研究展望
第五章 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间取得的科研成果
本文编号：3836336
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