牛传染性鼻气管炎病毒gB、gE基因截短片段的克隆与原核表达
发布时间：2023-08-30 02:26
IBRV 是牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)的病原。该病毒基因组编码12种糖蛋白,其中糖蛋白gB和糖蛋白gE是该病毒表面囊膜上的重要蛋白。gB基因是病毒复制所必须的,而gE基因则不是。本研究对IBRVgB、gE基因编码的蛋白进行了生物信息学分析,并根据分析结果对其抗原区片段进行克隆和原核表达。结果显示:(1)IBRVgB蛋白编码945aa,在第780-802和809-831位存在跨膜区域,无信号肽位点,蛋白链在300-450位亲水性、抗原性、表面可及性较高。IBRVgE蛋白编码597aa,在第422-444位置存在跨膜区域,在第28-29位置预测为存在信号肽剪切位点,蛋白链在110-225、450-550位亲水性、抗原性、表面可及性较高。(2)扩增出gB、gE基因的截短片段,长度分别为279bp和285bp。并成功构建了 pET-gB、pET-gE重组表达质粒,重组表达质粒最佳诱导时间为3小时,最佳IPTG浓度为1mmol/L。(3)重组表达质粒pET-gB、pET-gE在宿主表达菌BL21中诱导表达后均得到34KDa左右大...
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略语表
1 前言
1.1 病原
1.1.1 病毒形态结构
1.1.2 病毒理化特性与生物学特性
1.1.3 分子生物学特性
1.2 近年来IBR在我国流行情况
1.3 诊断方法
1.3.1 包涵体检查
1.3.2 病毒分离鉴定
1.3.3 血清学诊断
1.3.4 核酸诊断
1.4 IBR的防控
1.5 IBRV的gB、gE糖蛋白研究进展
1.5.1 gB糖蛋白
1.5.2 gE糖蛋白
1.6 生物信息学分析
1.7 研究的目的及意义
2 IBRV gB、gE基因生物信息学分析
2.1 材料
2.2 方法
2.3 结果
2.3.1 IBRV gB、gE糖蛋白跨膜结构域分析结果
2.3.2 IBRV gB、gE糖蛋白信号肽预测结果
2.3.3 gB、gE糖蛋白细胞抗原表位参数预测结果
2.4 讨论
3 IBRV截短gB、gE基因截短片段的PCR扩增、克隆及鉴定
3.1 材料
3.1.1 仪器与设备
3.1.2 主要试剂
3.1.3 载体与菌毒株
3.1.4 主要溶液的配置
3.1.5 引物的合成
3.2 方法
3.2.1 病毒基因组提取
3.2.2 对截短片段的PCR扩增
3.2.3 PCR产物电泳
3.2.4 凝胶回收PCR产物
3.2.5 连接
3.2.6 克隆质粒的转化
3.2.7 菌落的扩增培养
3.2.8 克隆质粒DNA的提取
3.2.9 pGEM-gB和pGEM-gE的鉴定
3.3 结果
3.3.1 PCR扩增结果
3.3.2 克隆质粒pGEM-gB和pGEM-gE PCR鉴定和双酶切鉴定结果
3.3.3 克隆质粒pGEM-gB和pGEM-gE测序鉴定结果
3.4 讨论
4 IBRV截短gB、gE基因的原核表达及鉴定
4.1 材料
4.1.1 仪器与设配
4.1.2 载体与菌株
4.1.3 主要试剂
4.1.4 主要溶液的配置
4.2 方法
4.2.1 克隆质粒和pET-32a载体的双酶切与回收
4.2.2 截短片段与pET-32a的连接与转化
4.2.3 pET-gB与pET-gE质粒的提取
4.2.4 pET-gB与pET-gE质粒的鉴定
4.2.5 重组gB和gE蛋白的诱导表达
4.2.6 SDS-PAGE电泳分析蛋白表达产物
4.2.7 免疫印迹鉴定
4.2.8 最佳诱导时间的优化
4.2.9 最佳IPTG浓度的优化
4.2.10 gE重组蛋白的纯化
4.3 结果
4.3.1 重组质粒pET-gB与pET-gE的PCR鉴定及双酶切鉴定结果
4.3.2 重组蛋白可溶性鉴定
4.3.3 免疫印迹鉴定结果
4.3.4 诱导时间优化结果
4.3.5 IPTG诱导浓度优化结果
4.3.6 gE重组蛋白的纯化结果
4.4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
作者简介
本文编号：3844753
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略语表
1 前言
1.1 病原
1.1.1 病毒形态结构
1.1.2 病毒理化特性与生物学特性
1.1.3 分子生物学特性
1.2 近年来IBR在我国流行情况
1.3 诊断方法
1.3.1 包涵体检查
1.3.2 病毒分离鉴定
1.3.3 血清学诊断
1.3.4 核酸诊断
1.4 IBR的防控
1.5 IBRV的gB、gE糖蛋白研究进展
1.5.1 gB糖蛋白
1.5.2 gE糖蛋白
1.6 生物信息学分析
1.7 研究的目的及意义
2 IBRV gB、gE基因生物信息学分析
2.1 材料
2.2 方法
2.3 结果
2.3.1 IBRV gB、gE糖蛋白跨膜结构域分析结果
2.3.2 IBRV gB、gE糖蛋白信号肽预测结果
2.3.3 gB、gE糖蛋白细胞抗原表位参数预测结果
2.4 讨论
3 IBRV截短gB、gE基因截短片段的PCR扩增、克隆及鉴定
3.1 材料
3.1.1 仪器与设备
3.1.2 主要试剂
3.1.3 载体与菌毒株
3.1.4 主要溶液的配置
3.1.5 引物的合成
3.2 方法
3.2.1 病毒基因组提取
3.2.2 对截短片段的PCR扩增
3.2.3 PCR产物电泳
3.2.4 凝胶回收PCR产物
3.2.5 连接
3.2.6 克隆质粒的转化
3.2.7 菌落的扩增培养
3.2.8 克隆质粒DNA的提取
3.2.9 pGEM-gB和pGEM-gE的鉴定
3.3 结果
3.3.1 PCR扩增结果
3.3.2 克隆质粒pGEM-gB和pGEM-gE PCR鉴定和双酶切鉴定结果
3.3.3 克隆质粒pGEM-gB和pGEM-gE测序鉴定结果
3.4 讨论
4 IBRV截短gB、gE基因的原核表达及鉴定
4.1 材料
4.1.1 仪器与设配
4.1.2 载体与菌株
4.1.3 主要试剂
4.1.4 主要溶液的配置
4.2 方法
4.2.1 克隆质粒和pET-32a载体的双酶切与回收
4.2.2 截短片段与pET-32a的连接与转化
4.2.3 pET-gB与pET-gE质粒的提取
4.2.4 pET-gB与pET-gE质粒的鉴定
4.2.5 重组gB和gE蛋白的诱导表达
4.2.6 SDS-PAGE电泳分析蛋白表达产物
4.2.7 免疫印迹鉴定
4.2.8 最佳诱导时间的优化
4.2.9 最佳IPTG浓度的优化
4.2.10 gE重组蛋白的纯化
4.3 结果
4.3.1 重组质粒pET-gB与pET-gE的PCR鉴定及双酶切鉴定结果
4.3.2 重组蛋白可溶性鉴定
4.3.3 免疫印迹鉴定结果
4.3.4 诱导时间优化结果
4.3.5 IPTG诱导浓度优化结果
4.3.6 gE重组蛋白的纯化结果
4.4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
作者简介
本文编号：3844753
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/benkebiyelunwen/3844753.html