水稻抗铝毒基因RAL1和SAL3的克隆和功能解析
发布时间：2023-01-30 10:06
铝毒害是植物生长在酸性土壤中面临的主要限制因子,游离的铝离子对植物根系生长有显著的抑制作用,从而限制了植物对土壤中水分和养分的吸收,最终导致整个植株的生长受到影响。水稻在长期适应酸性土壤的过程中进化出了多种抗铝毒机制,因此,以水稻为模式作物研究抗铝毒机制对于理解水稻的抗性机理和改良其他作物的酸性土壤适应性都有积极的作用。在本研究中,我们利用遗传筛选的手段对籼稻Kasalath诱变库进行了大规模的筛选,获得了多个表型稳定的突变体。我们对其中1个铝抗性突变体rall（resistant to aluminum1）和1个铝敏感水稻突变体sal3（sensitive to aluminum3）进行了深入研究。利用分离群体分组分析和高通量测序技术,我们克隆了 ral1和sal3的突变基因,通过对这两个突变体的表型分析和基因功能解析,我们发现了两种不同的水稻抗铝毒新机制,因此本研究的具体结果如下:（1）构建了籼稻Kasalath的EMS诱变库,并摸索出一种高效的籼稻铝突变体初筛方法,对诱变库进行了大量筛选,经过M3代和M4代的表型确认,最终获得了1个铝抗性突变体ral1和3个...
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写词英汉对照
第一章 文献综述
1 引言
2 铝对植物的毒害机理
2.1 土壤中铝的形态
2.2 铝对植物的毒害作用机制
2.2.1 植物铝毒害的症状
2.2.2 植物铝毒害作用位点
3 植物的抗铝毒机制
3.1 植物对铝的外排机制
3.2 植物对铝的耐受和解毒机制
3.2.1 细胞壁对铝的固定
3.2.2 细胞对铝的内部区室化
4 本研究的目的意义及主要内容
第二章 水稻突变体库的筛选
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 EMS诱变条件摸索
2.2.2 EMS诱变Kasalath群体
2.2.3 铝处理对根膨大突起的影响
2.2.4 铝处理或铝加AVG共同处理对根长的影响
2.2.5 根尖铝含量的测定
2.2.6 诱变库的筛选
3 结果与分析
3.1 Kasalath的EMS诱变库建立
3.2 诱变库筛选条件的摸索
3.3 诱变库的筛选结果
3.4 sal4的表型初步分析
4 讨论
5 本章小结
第三章 ral1的表型鉴定与遗传分析
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 不同金属处理或酸性土壤处理
2.2.2 Evans Blue染色和ER染色
2.2.3 ral1的切片观察
2.2.4 ral1抗铝毒基因表达
2.2.5 根尖铝含量的测定
2.2.6 突变基因的遗传分析
2.2.7 根生长动态曲线
2.2.8 RNA-seq测定样品准备
3 结果与分析
3.1 ral1抗铝毒能力显著高于野生型
3.2 ral1的根部切片和动态生长曲线
3.3 ral1中抗铝毒基因表达
3.4 ral1的根尖铝积累模式
3.5 ral1的遗传分析
3.6 ral1的转录组分析
4 讨论
5 本章小结
第四章 ral1的基因克隆与功能解析
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 突变基因克隆
2.2.2 BAL1回补载体的构建与农杆菌转化
2.2.3 突变基因的系统发生树
2.2.4 亚细胞定位和GUS染色
2.2.5 木质素含量测定
2.2.6 间苯三酚染色
2.2.7 CRISPR/cas9敲除
2.2.8 果胶含量测定
2.2.9 HPLC测定酚酸含量
2.2.10 铝吸收和去吸收动力学
2.2.11 阿魏酸和对香豆酸对根长的影响
2.2.12 GC-MS测定单糖含量
3 结果与分析
3.1 RAL1的克隆
3.2 RAL1的氨基酸改变和系统发生树
3.3 RAL1的组织表达和亚细胞定位
3.4 ral1短根和铝抗性增强与木质素含量无关
3.5 酚酸对半纤维素的修饰减少了细胞壁铝结合
4 讨论
5 本章小结
第五章 sal3的表型分析和基因克隆
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 不同pH处理、酸性土壤处理
2.2.2 根尖铝含量含量测定
2.2.3 抗铝毒基因表达
2.2.4 突变基因的图位克隆
2.2.5 亚细胞定位
2.2.6 EdU染色
2.2.7 酵母自激活验证
3 结果与分析
3.1 sal3对铝的敏感性
3.2 sal3突变基因的定位
3.3 sal3中抗铝毒相关基因的表达
3.4 SAL3的亚细胞定位
3.5 SAL3具有转录激活活性
4 讨论
5 本章小结
全文总结
1 主要结论
1.1 从Kasalath的EMS诱变库中的筛选获得突变体
1.2 克隆ral1的突变基因RAL1
1.3 RAL1的底物对香豆酸和阿魏酸对半纤维素的修饰阻碍了铝与半纤维素的结合
1.4 克隆sal3的突变基因SAL3
2 本文创新点
参考文献
附录
一、Kimura营养液配方
二、大肠杆菌感受态的转化
三、农杆菌感受态细胞制备与转化
四、抗生素和LB配置
五、高渗法提取水稻DNA
六、酵母点板及X-α-gal显色实验
在读期间发表的论文
致谢
本文编号：3732958
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写词英汉对照
第一章 文献综述
1 引言
2 铝对植物的毒害机理
2.1 土壤中铝的形态
2.2 铝对植物的毒害作用机制
2.2.1 植物铝毒害的症状
2.2.2 植物铝毒害作用位点
3 植物的抗铝毒机制
3.1 植物对铝的外排机制
3.2 植物对铝的耐受和解毒机制
3.2.1 细胞壁对铝的固定
3.2.2 细胞对铝的内部区室化
4 本研究的目的意义及主要内容
第二章 水稻突变体库的筛选
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 EMS诱变条件摸索
2.2.2 EMS诱变Kasalath群体
2.2.3 铝处理对根膨大突起的影响
2.2.4 铝处理或铝加AVG共同处理对根长的影响
2.2.5 根尖铝含量的测定
2.2.6 诱变库的筛选
3 结果与分析
3.1 Kasalath的EMS诱变库建立
3.2 诱变库筛选条件的摸索
3.3 诱变库的筛选结果
3.4 sal4的表型初步分析
4 讨论
5 本章小结
第三章 ral1的表型鉴定与遗传分析
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 不同金属处理或酸性土壤处理
2.2.2 Evans Blue染色和ER染色
2.2.3 ral1的切片观察
2.2.4 ral1抗铝毒基因表达
2.2.5 根尖铝含量的测定
2.2.6 突变基因的遗传分析
2.2.7 根生长动态曲线
2.2.8 RNA-seq测定样品准备
3 结果与分析
3.1 ral1抗铝毒能力显著高于野生型
3.2 ral1的根部切片和动态生长曲线
3.3 ral1中抗铝毒基因表达
3.4 ral1的根尖铝积累模式
3.5 ral1的遗传分析
3.6 ral1的转录组分析
4 讨论
5 本章小结
第四章 ral1的基因克隆与功能解析
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 突变基因克隆
2.2.2 BAL1回补载体的构建与农杆菌转化
2.2.3 突变基因的系统发生树
2.2.4 亚细胞定位和GUS染色
2.2.5 木质素含量测定
2.2.6 间苯三酚染色
2.2.7 CRISPR/cas9敲除
2.2.8 果胶含量测定
2.2.9 HPLC测定酚酸含量
2.2.10 铝吸收和去吸收动力学
2.2.11 阿魏酸和对香豆酸对根长的影响
2.2.12 GC-MS测定单糖含量
3 结果与分析
3.1 RAL1的克隆
3.2 RAL1的氨基酸改变和系统发生树
3.3 RAL1的组织表达和亚细胞定位
3.4 ral1短根和铝抗性增强与木质素含量无关
3.5 酚酸对半纤维素的修饰减少了细胞壁铝结合
4 讨论
5 本章小结
第五章 sal3的表型分析和基因克隆
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 不同pH处理、酸性土壤处理
2.2.2 根尖铝含量含量测定
2.2.3 抗铝毒基因表达
2.2.4 突变基因的图位克隆
2.2.5 亚细胞定位
2.2.6 EdU染色
2.2.7 酵母自激活验证
3 结果与分析
3.1 sal3对铝的敏感性
3.2 sal3突变基因的定位
3.3 sal3中抗铝毒相关基因的表达
3.4 SAL3的亚细胞定位
3.5 SAL3具有转录激活活性
4 讨论
5 本章小结
全文总结
1 主要结论
1.1 从Kasalath的EMS诱变库中的筛选获得突变体
1.2 克隆ral1的突变基因RAL1
1.3 RAL1的底物对香豆酸和阿魏酸对半纤维素的修饰阻碍了铝与半纤维素的结合
1.4 克隆sal3的突变基因SAL3
2 本文创新点
参考文献
附录
一、Kimura营养液配方
二、大肠杆菌感受态的转化
三、农杆菌感受态细胞制备与转化
四、抗生素和LB配置
五、高渗法提取水稻DNA
六、酵母点板及X-α-gal显色实验
在读期间发表的论文
致谢
本文编号：3732958
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3732958.html