ToCV检测方法建立、侵染性克隆构建及与植物蛋白互作分析
发布时间：2023-01-30 10:42
番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）为长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus）病毒,自2013年在我国山东爆发,现呈全国扩散趋势,严重威胁我国番茄等茄科重要经济作物的安全生产。加强该病毒的快速检测技术体系,病毒与寄主互作的分子机制等研究,可明确该病毒在我国的扩散分布,分析其对番茄等重要经济作物的潜在威胁,也可为该病毒病的科学防控提供技术手段和科学依据。利用原核表达的ToCV CP及HSP70蛋白作为抗原,制备获得CP蛋白和HSP70蛋白的多克隆抗体,稀释10,000倍,可特异性识别相应的抗原,为开发ToCV快速检测技术提供了技术资源。采用无缝克隆技术,构建了ToCV全长基因组cDNA侵染性克隆,利用农杆菌接种本氏烟BY2细胞和番茄,均接种不成功;农杆菌介导法接种本氏烟,接种成功率为15%。采用基因枪法,ToCV侵染性克隆质粒接种本氏烟和番茄,也均接种失败;利用PEG介导法接种本氏烟BY2细胞,ToCV侵染率可达60%。利用粉虱接种ToCV至番茄,采用相对定量技术测定接种病毒后番茄各部位的感病时间及病毒含量,结果表...
【文章页数】：98 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 番茄褪绿病毒
1.1.1 病毒简介
1.1.2 番茄褪绿病毒主要基因及其功能简介
1.1.3 番茄褪绿病毒检测技术
1.1.4 番茄褪绿病毒病主要防控技术
1.2 细胞自噬
1.2.1 细胞自噬的形式及过程
1.2.2 细胞自噬的分子机制
1.2.3 细胞自噬的研究方法
1.2.4 细胞自噬在抗病毒反应中的作用
1.2.5 细胞自噬防御病毒侵染的机制
1.2.6 病毒逃避被细胞自噬降解的分子机制
1.3 构建植物病毒侵染性克隆的方法及意义
1.3.1 侵染性克隆的种类及特点
1.3.2 构建侵染性克隆的方法
1.3.3 侵染性克隆在植物病毒研究中的应用
1.4 酵母双杂交技术原理以及在植物病毒研究中的应用
1.4.1 酵母双杂交的原理
1.4.2 酵母双杂交技术的优劣
1.4.3 酵母双杂交系统在植物病毒研究中的应用
1.5 本研究的目的和意义
第二章 番茄褪绿病毒CP及 HSP70 蛋白多克隆抗体制备
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.2 Trizol提取番茄叶片总RNA
2.1.3 RT-PCR扩增目的片段
2.1.4 大肠杆菌DH5α及 BL21 感受态的制备
2.1.5 原核表达载体构建
2.1.6 CP及 HSP70 蛋白的诱导表达及纯化
2.1.7 SDS-PAGE电泳
2.1.8 CP蛋白及HSP70 蛋白多克隆抗体制备及检测
2.2 结果与分析
2.2.1 番茄褪绿病毒CP及 HSP70 基因的扩增
2.2.2 目的基因连接克隆载体并测序
2.2.3 目的片段连接原核表达载体
2.2.4 阳性克隆的PCR鉴定
2.2.5 CP及 HSP70 蛋白的诱导表达及纯化
2.2.6 CP多克隆抗体检测
2.2.7 HSP70 多克隆抗体检测
2.3 小结与讨论
第三章 番茄褪绿病毒c DNA侵染性克隆构建
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 番茄褪绿病毒全基因组扩增
3.1.3 同源重组构建侵染性克隆
3.1.4 ToCV全基因组融合植物表达载体pCB-301-CH策略
3.1.5 利用农杆菌接种番茄褪绿病毒侵染性克隆
3.1.6 番茄褪绿病毒侵染性克隆接种BY2 细胞
3.1.7 利用基因枪接种本氏烟及番茄
3.1.8 dot-ELISA检测番茄褪绿病毒
3.1.9 RT-PCR检测番茄褪绿病毒
3.2 结果与分析
3.2.1 番茄褪绿病毒基因组全长扩增
3.2.2 获得的番茄褪绿病毒基因组片段连接克隆载体
3.2.3 植物表达载体和目的片段线性化
3.2.4 同源重组融合RNA11-4kb及 RNA21-4kb至载体
3.2.5 pCB-RNA1 1-4 kbp、pCB-RNA2 1-4 kbp质粒线性化及 RNA1 4-8 kbp、RNA2 4-8 kbp 片段扩增
3.2.6 番茄褪绿病毒侵染性克隆载体构建
3.2.7 农杆菌接种番茄褪绿病毒侵染性克隆
3.2.8 番茄褪绿病毒侵染性克隆接种BY2 细胞
3.2.9 基因枪接种番茄褪绿病毒侵染性克隆
3.3 小结与讨论
第四章 番茄褪绿病毒激活番茄自噬体途径促进病毒复制
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 MDC染色观察叶片中自噬小泡数量
4.1.3 Western Blotting检测LC3II/I蛋白的含量
4.1.4 细胞自噬激活/抑制剂处理番茄后对叶片中ToCV病毒含量的影响
4.2 结果与分析
4.2.1 MDC染色观察BY2 细胞及番茄叶片中自噬小泡数量
4.2.2 Western Blotting检测LC3II/LC3I蛋白含量
4.2.3 细胞自噬体途径对ToCV病毒复制的影响
4.3 小结与讨论
第五章 番茄褪绿病毒衣壳蛋白CP/CPm与自噬蛋白互作
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 番茄接种番茄褪绿病毒的发病时间及病毒在寄主中的扩散趋势
5.1.3 番茄感染番茄褪绿病毒后ATG相关基因的荧光定量分析
5.1.4 同源重组构建番茄褪绿病毒CP、CPm及番茄ATG蛋白酵母表达载体
5.1.5 酵母双杂交实验
5.1.6 CP及 CPm蛋白互作结构域筛选
5.2 结果与分析
5.2.1 番茄褪绿病毒在寄主中的扩散趋势
5.2.2 自噬相关基因表达量分析
5.2.3 无缝克隆技术构建酵母表达载体
5.2.4 酵母双杂技术筛选与CP或 CPm互作的寄主靶标蛋白
5.2.5 CP或 CPm与寄主蛋白的互作结构域筛选
5.3 小结与讨论
结论与展望
参考文献
附录 A 攻读学位期间发表的学术论文目录
附录 B 主要试剂的配方
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]西花蓟马酵母双杂交文库及TSWV膜蛋白诱饵载体的构建[J]. 万岩然,郑晓斌,袁江江,张友军,吴青君. 应用昆虫学报. 2019(01)
[2]侵染甘薯的菜豆金色花叶病毒属病毒和甘薯褪绿矮化病毒多重PCR检测方法的建立与应用[J]. 王爽,田雨婷,乔奇,秦艳红,张德胜,张振臣. 植物保护学报. 2018(06)
[3]葡萄病毒A实时荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用[J]. 任芳,董雅凤,张尊平,范旭东,胡国君. 园艺学报. 2018(11)
[4]细胞自噬研究方法的比较与分析[J]. 李志元,张欣. 生物学杂志. 2018(04)
[5]水稻幼苗酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定[J]. 朱佳慧,徐秋芳,袁平平,倪海平,周益军,蒋选利,杜何为. 江苏农业科学. 2018(09)
[6]番茄花柄脱落过程的酵母双杂交cDNA文库构建[J]. 姜赟,史自航,付欣,成丽娜,张璐,葛思琪,许涛,李天来. 沈阳农业大学学报. 2018(02)
[7]植物细胞自噬研究进展[J]. 刘洋,张静,王秋玲,侯岁稳. 植物学报. 2018(01)
[8]白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建[J]. 薛进,李静,羊健,唐彦,梁瑶,陈剑平,张恒木. 浙江农业学报. 2017(12)
[9]水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建[J]. 邱牡丹,李莉,李懿星,王建龙. 基因组学与应用生物学. 2018(10)
[10]白菜翻译起始因子eIF（iso）4E.a/c与芜菁花叶病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析[J]. 李国亮,钱伟,张淑江,李菲,章时藩,张慧,谢露露,武剑,王晓武,孙日飞. 园艺学报. 2017(07)
博士论文
[1]酸性微环境诱导肺癌细胞自噬及其分子机制[D]. 谢文跃.重庆医科大学 2016
[2]GAPCs在细胞自噬和植物免疫中的功能研究[D]. 韩少杰.清华大学 2015
[3]控制茄子果型相关性状关键基因的克隆及功能研究[D]. 韩洪强.上海交通大学 2014
[4]与传播水稻条纹病毒相关的灰飞虱蛋白质鉴定与功能研究[D]. 刘文文.中国农业科学院 2013
[5]烟粉虱Q型替代B型的生态学机制研究[D]. 潘慧鹏.中国农业科学院 2012
[6]利用酵母双杂交系统研究水稻条纹病毒与寄主水稻之间的互作[D]. 鹿连明.福建农林大学 2008
硕士论文
[1]烟粉虱带毒前后中肠基因表达分析及与病毒互作的烟粉虱蛋白筛选[D]. 耿亮.浙江大学 2017
[2]白菜eIF（iso）4E基因对TuMV的抗性机制研究[D]. 李国亮.中国农业科学院 2016
[3]甘蔗条纹花叶病毒分子遗传进化及其编码的RNA沉默抑制子功能鉴定[D]. 付卫林.福建农林大学 2015
[4]芜菁花叶病毒CDN1株系植物表达载体构建和芜菁花叶病毒CHN5株系cDNA克隆[D]. 郑文光.湖南农业大学 2003
本文编号：3732986
【文章页数】：98 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 番茄褪绿病毒
1.1.1 病毒简介
1.1.2 番茄褪绿病毒主要基因及其功能简介
1.1.3 番茄褪绿病毒检测技术
1.1.4 番茄褪绿病毒病主要防控技术
1.2 细胞自噬
1.2.1 细胞自噬的形式及过程
1.2.2 细胞自噬的分子机制
1.2.3 细胞自噬的研究方法
1.2.4 细胞自噬在抗病毒反应中的作用
1.2.5 细胞自噬防御病毒侵染的机制
1.2.6 病毒逃避被细胞自噬降解的分子机制
1.3 构建植物病毒侵染性克隆的方法及意义
1.3.1 侵染性克隆的种类及特点
1.3.2 构建侵染性克隆的方法
1.3.3 侵染性克隆在植物病毒研究中的应用
1.4 酵母双杂交技术原理以及在植物病毒研究中的应用
1.4.1 酵母双杂交的原理
1.4.2 酵母双杂交技术的优劣
1.4.3 酵母双杂交系统在植物病毒研究中的应用
1.5 本研究的目的和意义
第二章 番茄褪绿病毒CP及 HSP70 蛋白多克隆抗体制备
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.2 Trizol提取番茄叶片总RNA
2.1.3 RT-PCR扩增目的片段
2.1.4 大肠杆菌DH5α及 BL21 感受态的制备
2.1.5 原核表达载体构建
2.1.6 CP及 HSP70 蛋白的诱导表达及纯化
2.1.7 SDS-PAGE电泳
2.1.8 CP蛋白及HSP70 蛋白多克隆抗体制备及检测
2.2 结果与分析
2.2.1 番茄褪绿病毒CP及 HSP70 基因的扩增
2.2.2 目的基因连接克隆载体并测序
2.2.3 目的片段连接原核表达载体
2.2.4 阳性克隆的PCR鉴定
2.2.5 CP及 HSP70 蛋白的诱导表达及纯化
2.2.6 CP多克隆抗体检测
2.2.7 HSP70 多克隆抗体检测
2.3 小结与讨论
第三章 番茄褪绿病毒c DNA侵染性克隆构建
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 番茄褪绿病毒全基因组扩增
3.1.3 同源重组构建侵染性克隆
3.1.4 ToCV全基因组融合植物表达载体pCB-301-CH策略
3.1.5 利用农杆菌接种番茄褪绿病毒侵染性克隆
3.1.6 番茄褪绿病毒侵染性克隆接种BY2 细胞
3.1.7 利用基因枪接种本氏烟及番茄
3.1.8 dot-ELISA检测番茄褪绿病毒
3.1.9 RT-PCR检测番茄褪绿病毒
3.2 结果与分析
3.2.1 番茄褪绿病毒基因组全长扩增
3.2.2 获得的番茄褪绿病毒基因组片段连接克隆载体
3.2.3 植物表达载体和目的片段线性化
3.2.4 同源重组融合RNA11-4kb及 RNA21-4kb至载体
3.2.5 pCB-RNA1 1-4 kbp、pCB-RNA2 1-4 kbp质粒线性化及 RNA1 4-8 kbp、RNA2 4-8 kbp 片段扩增
3.2.6 番茄褪绿病毒侵染性克隆载体构建
3.2.7 农杆菌接种番茄褪绿病毒侵染性克隆
3.2.8 番茄褪绿病毒侵染性克隆接种BY2 细胞
3.2.9 基因枪接种番茄褪绿病毒侵染性克隆
3.3 小结与讨论
第四章 番茄褪绿病毒激活番茄自噬体途径促进病毒复制
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 MDC染色观察叶片中自噬小泡数量
4.1.3 Western Blotting检测LC3II/I蛋白的含量
4.1.4 细胞自噬激活/抑制剂处理番茄后对叶片中ToCV病毒含量的影响
4.2 结果与分析
4.2.1 MDC染色观察BY2 细胞及番茄叶片中自噬小泡数量
4.2.2 Western Blotting检测LC3II/LC3I蛋白含量
4.2.3 细胞自噬体途径对ToCV病毒复制的影响
4.3 小结与讨论
第五章 番茄褪绿病毒衣壳蛋白CP/CPm与自噬蛋白互作
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 番茄接种番茄褪绿病毒的发病时间及病毒在寄主中的扩散趋势
5.1.3 番茄感染番茄褪绿病毒后ATG相关基因的荧光定量分析
5.1.4 同源重组构建番茄褪绿病毒CP、CPm及番茄ATG蛋白酵母表达载体
5.1.5 酵母双杂交实验
5.1.6 CP及 CPm蛋白互作结构域筛选
5.2 结果与分析
5.2.1 番茄褪绿病毒在寄主中的扩散趋势
5.2.2 自噬相关基因表达量分析
5.2.3 无缝克隆技术构建酵母表达载体
5.2.4 酵母双杂技术筛选与CP或 CPm互作的寄主靶标蛋白
5.2.5 CP或 CPm与寄主蛋白的互作结构域筛选
5.3 小结与讨论
结论与展望
参考文献
附录 A 攻读学位期间发表的学术论文目录
附录 B 主要试剂的配方
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]西花蓟马酵母双杂交文库及TSWV膜蛋白诱饵载体的构建[J]. 万岩然,郑晓斌,袁江江,张友军,吴青君. 应用昆虫学报. 2019(01)
[2]侵染甘薯的菜豆金色花叶病毒属病毒和甘薯褪绿矮化病毒多重PCR检测方法的建立与应用[J]. 王爽,田雨婷,乔奇,秦艳红,张德胜,张振臣. 植物保护学报. 2018(06)
[3]葡萄病毒A实时荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用[J]. 任芳,董雅凤,张尊平,范旭东,胡国君. 园艺学报. 2018(11)
[4]细胞自噬研究方法的比较与分析[J]. 李志元,张欣. 生物学杂志. 2018(04)
[5]水稻幼苗酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定[J]. 朱佳慧,徐秋芳,袁平平,倪海平,周益军,蒋选利,杜何为. 江苏农业科学. 2018(09)
[6]番茄花柄脱落过程的酵母双杂交cDNA文库构建[J]. 姜赟,史自航,付欣,成丽娜,张璐,葛思琪,许涛,李天来. 沈阳农业大学学报. 2018(02)
[7]植物细胞自噬研究进展[J]. 刘洋,张静,王秋玲,侯岁稳. 植物学报. 2018(01)
[8]白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建[J]. 薛进,李静,羊健,唐彦,梁瑶,陈剑平,张恒木. 浙江农业学报. 2017(12)
[9]水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建[J]. 邱牡丹,李莉,李懿星,王建龙. 基因组学与应用生物学. 2018(10)
[10]白菜翻译起始因子eIF（iso）4E.a/c与芜菁花叶病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析[J]. 李国亮,钱伟,张淑江,李菲,章时藩,张慧,谢露露,武剑,王晓武,孙日飞. 园艺学报. 2017(07)
博士论文
[1]酸性微环境诱导肺癌细胞自噬及其分子机制[D]. 谢文跃.重庆医科大学 2016
[2]GAPCs在细胞自噬和植物免疫中的功能研究[D]. 韩少杰.清华大学 2015
[3]控制茄子果型相关性状关键基因的克隆及功能研究[D]. 韩洪强.上海交通大学 2014
[4]与传播水稻条纹病毒相关的灰飞虱蛋白质鉴定与功能研究[D]. 刘文文.中国农业科学院 2013
[5]烟粉虱Q型替代B型的生态学机制研究[D]. 潘慧鹏.中国农业科学院 2012
[6]利用酵母双杂交系统研究水稻条纹病毒与寄主水稻之间的互作[D]. 鹿连明.福建农林大学 2008
硕士论文
[1]烟粉虱带毒前后中肠基因表达分析及与病毒互作的烟粉虱蛋白筛选[D]. 耿亮.浙江大学 2017
[2]白菜eIF（iso）4E基因对TuMV的抗性机制研究[D]. 李国亮.中国农业科学院 2016
[3]甘蔗条纹花叶病毒分子遗传进化及其编码的RNA沉默抑制子功能鉴定[D]. 付卫林.福建农林大学 2015
[4]芜菁花叶病毒CDN1株系植物表达载体构建和芜菁花叶病毒CHN5株系cDNA克隆[D]. 郑文光.湖南农业大学 2003
本文编号：3732986
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