广西壮族自治区PRRSV、PCV3病原学检测及IFITM抑制PRRSV复制作用的研究
发布时间：2023-02-01 12:34
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起的一种高度接触性传染病。PRRSV属于动脉炎病毒科,是一种单股正链RNA病毒,基因组全长为15kb左右,可编码至少10个开放阅读框。PRRSV有两种基因型,分别为基因1型和基因2型。我国目前普遍流行的高致病性PRRSV毒株大部分属于Lineage8（JXA1、HuN4等）。Lineage1,也被称作是NADC30-like株,于2013年开始在我国境内流行,并再次引起了PRRS疫情。Lineage1和Lineage8均属于基因2型。猪2型圆环病毒（Porcine Circovirus 2,PCV2）是一种单股负链DNA病毒,属于环状病毒科,是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原体。PCV2单独感染很少引起临床症状,常见与PRRSV发生混合感染。PRRSV和PCV2混合感染,与两种病毒单独感染相比能够加重疾病,产生许多种明显的...
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要 Abstract 前言 第一章 广西壮族自治区PRRSV病原学检测
1.1 材料
1.1.1 细胞
1.1.2 病料采集
1.1.3 主要试剂
1.1.4 主要仪器设备
1.1.5 相关试剂配制
1.1.6 引物设计与合成
1.1.7 分子生物学软件
1.2 实验方法
1.2.1 病料的采集与处理
1.2.2 组织样品总RNA提取
1.2.3 RNA反转录
1.2.4 PCR检测
1.2.5 PRRSVPCR扩增产物回收
1.2.6 pEASY-Bluntcloning载体的构建
1.2.7 PRRSV病毒的分离鉴定
1.2.8 PRRSV致病性分析
1.3 结果
1.3.1 PRRSVRT-PCR检测结果
1.3.2 PRRSV主要基因片段遗传进化分析及氨基酸序列比对
1.3.3 PRRSV分离鉴定
1.3.4 GXBB16-1致病性检测
1.3.5 GXBB16-1全基因序列分析
1.4 讨论
1.5 小结 第二章 广西壮族自治区PCV3病原学检测
2.1 材料
2.1.1 病料采集
2.1.2 主要试剂
2.1.3 相关试剂配制
2.1.4 引物设计与合成
2.2 实验方法
2.2.1 病料的采集和处理
2.2.2 组织样品中基因组DNA提取
2.2.3 PCR检测DNA样品中的PCV
2.2.4 pMD18T载体的构建
2.2.5 pMD18T载体转化Trans5α感受态细胞
2.2.6 质粒PCR、酶切鉴定
2.2.7 RealtimePCR反应
2.2.8 PCV3荧光定量检测方法的建立
2.2.9 PCV3全基因序列扩增测序
2.2.10 PCV3全基因序列生物信息学分析
2.3 结果
2.3.1 PCV3荧光定量检测方法的建立
2.3.2 广西地区PCV3基因全长测序及遗传进化分析
2.4 讨论
2.5 小结 第三章 猪IFITM抗PRRSV作用研究
3.1 材料方法
3.1.1 毒株
3.1.2 质粒
3.1.3 实验动物
3.1.4 主要试剂
3.1.5 主要仪器设备
3.1.6 引物设计与合成
3.2 实验方法
3.2.1 原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)的分离
3.2.2 猪原代外周血淋巴细胞(PBMC)的分离
3.2.3 接毒
3.2.4 接种PRRSV的PAM、PBMC细胞中IFITM基因表达变化
3.2.5 猪IFITM慢病毒包装
3.2.6 Marc145嘌呤霉素敏感性实验
3.2.7 慢病毒感染构建Marc145-IFITM稳定表达细胞系
3.2.8 荧光定量PCR分析IFITM抑制PRRSV复制作用
3.2.9 间接免疫荧光分析IFITM抑制PRRSV复制作用
3.2.10 Westernblot分析IFITM抑制PRRSV复制作用
3.2.11 siRNA转染
3.3 结果
3.3.1 荧光定量PCR引物扩增产物的特异性判断
3.3.2 感染GXBB16-1后的PAM细胞IFITM基因转录水平显著上调
3.3.3 感染GXBB16-1后的PBMC细胞IFITM基因转录水平显著上调
3.3.4 猪IFITM分子氨基酸序列比对
3.3.5 Marc145细胞对嘌呤霉素敏感性检测
3.3.6 Marc145-IFITMs细胞系构建及鉴定
3.3.7 IFITM在Marc145细胞中稳定表达对PRRSV复制的影响
3.3.8 SiRNA干扰效率检测
3.3.9 敲低IFITM3的表达对病毒复制的影响
3.4 讨论
3.5 小结 第四章 结论与展望 参考文献 作者在学期间取得的学术成果 主要简历 致谢
本文编号：3734176
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【学位级别】：博士
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摘要 Abstract 前言 第一章 广西壮族自治区PRRSV病原学检测
1.1 材料
1.1.1 细胞
1.1.2 病料采集
1.1.3 主要试剂
1.1.4 主要仪器设备
1.1.5 相关试剂配制
1.1.6 引物设计与合成
1.1.7 分子生物学软件
1.2 实验方法
1.2.1 病料的采集与处理
1.2.2 组织样品总RNA提取
1.2.3 RNA反转录
1.2.4 PCR检测
1.2.5 PRRSVPCR扩增产物回收
1.2.6 pEASY-Bluntcloning载体的构建
1.2.7 PRRSV病毒的分离鉴定
1.2.8 PRRSV致病性分析
1.3 结果
1.3.1 PRRSVRT-PCR检测结果
1.3.2 PRRSV主要基因片段遗传进化分析及氨基酸序列比对
1.3.3 PRRSV分离鉴定
1.3.4 GXBB16-1致病性检测
1.3.5 GXBB16-1全基因序列分析
1.4 讨论
1.5 小结 第二章 广西壮族自治区PCV3病原学检测
2.1 材料
2.1.1 病料采集
2.1.2 主要试剂
2.1.3 相关试剂配制
2.1.4 引物设计与合成
2.2 实验方法
2.2.1 病料的采集和处理
2.2.2 组织样品中基因组DNA提取
2.2.3 PCR检测DNA样品中的PCV
2.2.4 pMD18T载体的构建
2.2.5 pMD18T载体转化Trans5α感受态细胞
2.2.6 质粒PCR、酶切鉴定
2.2.7 RealtimePCR反应
2.2.8 PCV3荧光定量检测方法的建立
2.2.9 PCV3全基因序列扩增测序
2.2.10 PCV3全基因序列生物信息学分析
2.3 结果
2.3.1 PCV3荧光定量检测方法的建立
2.3.2 广西地区PCV3基因全长测序及遗传进化分析
2.4 讨论
2.5 小结 第三章 猪IFITM抗PRRSV作用研究
3.1 材料方法
3.1.1 毒株
3.1.2 质粒
3.1.3 实验动物
3.1.4 主要试剂
3.1.5 主要仪器设备
3.1.6 引物设计与合成
3.2 实验方法
3.2.1 原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)的分离
3.2.2 猪原代外周血淋巴细胞(PBMC)的分离
3.2.3 接毒
3.2.4 接种PRRSV的PAM、PBMC细胞中IFITM基因表达变化
3.2.5 猪IFITM慢病毒包装
3.2.6 Marc145嘌呤霉素敏感性实验
3.2.7 慢病毒感染构建Marc145-IFITM稳定表达细胞系
3.2.8 荧光定量PCR分析IFITM抑制PRRSV复制作用
3.2.9 间接免疫荧光分析IFITM抑制PRRSV复制作用
3.2.10 Westernblot分析IFITM抑制PRRSV复制作用
3.2.11 siRNA转染
3.3 结果
3.3.1 荧光定量PCR引物扩增产物的特异性判断
3.3.2 感染GXBB16-1后的PAM细胞IFITM基因转录水平显著上调
3.3.3 感染GXBB16-1后的PBMC细胞IFITM基因转录水平显著上调
3.3.4 猪IFITM分子氨基酸序列比对
3.3.5 Marc145细胞对嘌呤霉素敏感性检测
3.3.6 Marc145-IFITMs细胞系构建及鉴定
3.3.7 IFITM在Marc145细胞中稳定表达对PRRSV复制的影响
3.3.8 SiRNA干扰效率检测
3.3.9 敲低IFITM3的表达对病毒复制的影响
3.4 讨论
3.5 小结 第四章 结论与展望 参考文献 作者在学期间取得的学术成果 主要简历 致谢
本文编号：3734176
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