口蹄疫病毒感染拮抗宿主蛋白RIP2抗病毒反应的机理研究

发布时间：2023-02-05 09:43

　　口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的急性、热性、高度接触性传染病。机体的天然免疫反应和接种疫苗后产生的适应性免疫应答是抵抗病原菌感染的重要防线。然而,FMDV变异快,血清型众多,且各血清型之间缺乏交叉保护,给FMD的防控增加了难度。因此,天然免疫应答在抵抗FMDV感染过程中至关重要。FMDV在长期增殖过程中已经进化多种策略抑制宿主的天然免疫应答,促进自身复制。例如,FMDV可通过多种途径拮抗TLRs和RLRs受体介导的天然免疫信号通路。NOD2信号通路是2009年发现的在抗病毒感染中发挥重要作用的天然免疫路径,NOD2蛋白及其下游RIP2蛋白是该通路中独特的分子,本实验室前期研究揭示了FMDV抑制NOD2信号通路的分子机制,然而RIP2在FMDV感染过程中发挥的作用仍不清楚。因此,本研究主要以FMDV与RIP2调控的天然免疫信号通路为切入点,探讨FMDV拮抗RIP2抗病毒作用的机制。具体内容如下:(1)利用荧光素酶报告系统证实RIP2可影响FMDV诱导的IFN-β和NF-...

【文章页数】：118 页

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摘要
Summary
英文缩略词表
第一章 文献综述
    1.1 口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)的概况
        1.1.1 口蹄疫病毒的结构
        1.1.2 FMDV的流行趋势及致病性
        1.1.3 FMDV的防控及疫苗
    1.2 天然免疫系统
        1.2.1 TLRs介导的抗病毒天然免疫
        1.2.2 RLRs介导的抗病毒天然免疫
        1.2.3 NLRs介导的抗病毒天然免疫
        1.2.4 胞浆DNA受体介导的抗病毒天然免疫
        1.2.5 泛素化修饰调控的抗病毒天然免疫
        1.2.6 磷酸化修饰调控的抗病毒天然免疫
    1.3 FMDV调控宿主抗病毒天然免疫的研究
    1.4 本研究的目的意义及研究内容
第二章 RIP2 影响FMDV诱导的信号通路
    2.1 材料与方法
        2.1.1 细胞、病毒和工程菌
        2.1.2 质粒和抗体
        2.1.3 工具酶和主要试剂
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 主要试剂的配置
        2.1.6 质粒的转化
        2.1.7 质粒的大量提取
        2.1.8 真核表达质粒和RNA的转染
        2.1.9 细胞RNA的提取及cDNA反转录
        2.1.10 实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)
        2.1.11 细胞的冻存和复苏
        2.1.12 FMDV的增殖
        2.1.13 FMDV感染
        2.1.14 蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)
        2.1.15 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)
        2.1.16 双荧光素酶报告基因的检测
        2.1.17 数据统计分析
    2.2 结果
        2.2.1 FMDV感染激活RIP2 介导的信号通路
        2.2.2 RIP2 影响FMDV诱导的P65和IRF3 的磷酸化
        2.2.3 RIP2 影响FMDV诱导的下游抗病毒基因的表达水平
    2.3 讨论
第三章 RIP2对FMDV复制的影响
    3.1 材料与方法
        3.1.1 细胞、病毒和工程菌
        3.1.2 质粒和抗体
        3.1.3 工具酶和主要试剂
        3.1.4 主要仪器
        3.1.5 主要试剂的配置
        3.1.6 质粒的瞬时转染(Lipofectamine3000)
        3.1.7 病毒滴度
        3.1.8 细胞RNA的提取及cDNA反转录
        3.1.9 实时荧光定量PCR(qPCR)
        3.1.10 数据统计分析
    3.2 结果
        3.2.1 过表达RIP2 抑制FMDV复制
        3.2.2 小RNA干扰RIP2 蛋白表达水平后促进FMDV复制
    3.3 讨论
第四章 FMDV感染降低RIP2 的蛋白表达水平
    4.1 材料与方法
        4.1.1 细胞与病毒
        4.1.2 抗体
        4.1.3 工具酶和主要试剂
        4.1.4 主要仪器
        4.1.5 细胞RNA提取及反转录
        4.1.6 实时荧光定量PCR(qPCR)
        4.1.7 蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)
        4.1.8 数据统计分析
    4.2 结果
        4.2.1 FMDV感染上调RIP2 mRNA表达水平
        4.2.2 FMDV感染降低RIP2 蛋白表达水平
        4.2.3 FMDV感染降低RIP和 RIP3 蛋白表达水平
        4.2.4 EV71感染降低RIP2蛋白表达水平
    4.3 讨论
第五章 FMDV降低RIP2 蛋白表达水平的机制
    5.1 材料与方法
        5.1.1 细胞与病毒
        5.1.2 质粒与抗体
        5.1.3 工具酶和主要试剂
        5.1.4 主要仪器
        5.1.5 细胞RNA提取及反转录
        5.1.6 实时荧光定量PCR(qPCR)
        5.1.7 MTS实验
        5.1.8 主要试剂的配制
        5.1.9 蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)
        5.1.10 数据统计分析
    5.2 结果
        5.2.1 FMDV2B、2C、L^pro和3C^pro蛋白降低内源性RIP2 蛋白表达水平
        5.2.2 FMDV2B、2C、L^pro和3C^pro不降低RIP2 mRNA水平
        5.2.3 FMDV2B降低RIP2 蛋白表达水平的机制
        5.2.4 FMDV2C降低RIP2 蛋白表达水平的机制
        5.2.5 FMDV L^pro和3C^pro降低RIP2 蛋白表达水平的机制
    5.3 讨论
第六章 FMDV2C与 RIP2 相互作用
    6.1 材料与方法
        6.1.1 细胞、病毒和工程菌
        6.1.2 质粒和抗体
        6.1.3 工具酶和主要试剂
        6.1.4 主要仪器
        6.1.5 主要试剂的配置
        6.1.6 免疫共沉淀实验
    6.2 结果
        6.2.1 FMDV2C与 RIP2 外源性互作
        6.2.2 FMDV2C与 RIP2 内源性互作
        6.2.3 FMDV2C与 RIP2 的互作位点
    6.3 讨论
第七章 FMDV2C降低RIP2 蛋白表达水平的机制
    7.1 材料与方法
        7.1.1 细胞与病毒
        7.1.2 质粒与抗体
        7.1.3 工具酶和主要试剂
        7.1.4 主要仪器
        7.1.5 RNA的转染
        7.1.6 细胞RNA提取及反转录
        7.1.7 实时荧光定量PCR(qPCR)
        7.1.8 蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)
        7.1.9 数据统计分析
    7.2 结果
        7.2.1 FMDV2C降低PABPC1 的蛋白表达水平
        7.2.2 FMDV2C降低PABPC1 蛋白表达水平的位点
        7.2.3 PABPC1 蛋白干扰后抑制了RIP2 的蛋白表达水平
    7.3 讨论
全文结论
参考文献
致谢
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本文编号：3734748