抗赤霉病相关基因转化小麦及其抗病性分析

发布时间：2023-03-24 18:38

　　小麦赤霉病是由镰刀菌引起的一种世界范围内广泛流行的真菌病害。近年来,由于全球气候变暖和耕作制度、耕作方式的改变,小麦赤霉病显现逐年加重和大流行的趋势,对农业生产构成严重威胁。小麦赤霉病主要发生在穗期,造成穗腐,也可以在苗期引起苗枯、基腐等症状,它的发生不仅造成产量和品质的下降,而且产生多种毒素,影响食品安全及人畜健康。培育和推广抗赤霉病的小麦品种,是控制小麦赤霉病的有效途径。但是,由于小麦-镰刀菌互作机制复杂,小麦品种天然抗病资源稀少,抗性遗传基础狭窄,利用常规育种培育抗病且综合性状优良的品种难度较大。基因工程育种技术的日趋成熟为解决这一难题提供了新的途径。既可利用小麦天然抗源外,还可以充分利用其他植物、动物和微生物的抗病基因资源,通过转基因技术创造目标性状突出且综合性状优良的抗赤霉病新品系,具有广阔的发展与应用前景。本研究采用基因枪介导的最小表达框转化法,将来源与抗性机制不同的抗赤霉病相关基因导入郑麦9023,扬麦158以及扬麦15等我国小麦主栽品种,旨在为小麦抗赤霉病转基因育种创造新材料。主要结果如下:1.以郑麦9023为受体品种,成功导入了由大麦颖壳特异Lem2启动子驱动的抗体融...

【文章页数】：117 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
    1.1 研究背景
    1.2 小麦遗传转化研究进展
        1.2.1 小麦遗传转化的方法
            1.2.1.1 基因枪法
            1.2.1.2 农杆菌介导法
            1.2.1.3 其他转化方法
        1.2.2 筛选标记基因的选择
        1.2.3 基因枪介导的最小表达框转化法
        1.2.4 如何提高外源基因的高效与稳定表达
            1.2.4.1 转化方法的选择
            1.2.4.2 不同启动子的应用
            1.2.4.3 MAR的应用
            1.2.4.4 对外源基因进行优化
    1.3 抗赤霉病转基因小麦研究进展
    1.4 HIGS技术在植物真菌病害防治中的应用
        1.4.1 HIGS技术的概念
        1.4.2 HIGS技术在植物抗真菌病害领域的最新研究进展
        1.4.3 HIGS技术在植物真菌病害防治的策略
            1.4.3.1 选择或筛选有效的病原菌靶标基因
            1.4.3.2 植物RNAi表达载体的构建与HIGS转基因植物的获得
            1.4.3.3 HIGS转基因植物的分子检测与抗病性分析
    1.5 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒DNA的提取
            2.2.1.1 试剂盒法提取质粒DNA
            2.2.1.2 煮沸法提取质粒DNA
        2.2.2 最小表达框的制备
        2.2.3 基因枪法介导的小麦遗传转化过程
        2.2.4 小麦基因组DNA的提取（CTAB法）
        2.2.5 PCR鉴定
        2.2.6 Southern杂交分析
            2.2.6.1 小麦基因组DNA酶切及电泳
            2.2.6.2 转膜
            2.2.6.3 预杂交
            2.2.6.4 杂交探针的制备
            2.2.6.5 杂交
            2.2.6.6 洗膜
            2.2.6.7 放射自显影
        2.2.7 RNA的提取和cDNA逆转录
            2.2.7.1 Trizol法提取总RNA
            2.2.7.2 去除总RNA中的基因组DNA
            2.2.7.3 cDNA逆转录
        2.2.8 qRT-PCR分析
        2.2.9 siRNA Northern blot分析
            2.2.9.1 小RNA的提取
            2.2.9.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
            2.2.9.3 转膜
            2.2.9.4 预杂交与杂交
            2.2.9.5 洗膜与放射自显影
        2.2.10 赤霉病接种鉴定
            2.2.10.1 镰刀菌孢子5035悬浮液的制备
            2.2.10.2 苗期接种
            2.2.10.3 单花接种
            2.2.10.4 自然感病接种
        2.2.11 毒素测定
        2.2.12 组织化学染色与显微观察
            2.2.12.1 乳酚蓝染色
            2.2.12.2 Calcofluor White（CFW）染色
        2.2.13 白粉病接种鉴定
3 实验结果与分析
    3.1 Lem2 启动子驱动的Ech42CWP2 提高小麦赤霉病抗性的研究
        3.1.1 pUPL-Ech42CWP2 载体构建与最小表达框的制备
        3.1.2 转Lem2-Ech42CWP2 基因小麦的遗传转化过程
        3.1.3 转Lem2-Ech42CWP2 基因小麦的分子鉴定
            3.1.3.1 PCR鉴定
            3.1.3.2 Southern blot分析
        3.1.4 外源基因Ech42CWP2 的表达模式分析
        3.1.5 转Lem2-Ech42CWP2 基因小麦的赤霉病抗性鉴定
            3.1.5.1 单花接种鉴定
            3.1.5.2 自然接种鉴定
            3.1.5.3 毒素测定
        3.1.6 H13×Z1 和H13×Z4 杂交株系F4 代的赤霉病抗性鉴定
        3.1.7 SA处理与Fg接种对外源基因Ech42CWP2 表达水平的影响
        3.1.8 SA处理与Fg接种对转基因小麦赤霉病抗性的影响
    3.2 转Ech42，ACE和ZmGC基因小麦的获得及其赤霉病抗性分析
        3.2.1 转Ech42，ACE和ZmGC基因小麦的获得
            3.2.1.1 最小表达框的制备
            3.2.1.2 转Ech42，ACE和ZmGC基因小麦的遗传转化过程
        3.2.2 转Ech42，ACE和ZmGC基因小麦的分子鉴定
            3.2.2.1 PCR与RT-PCR检测
            3.2.2.2 Southern blot分析
        3.2.3 转Ech42，ACE和ZmGC基因小麦抗赤霉病株系的筛选
        3.2.4 转基因株系Y3b-1 的赤霉病抗性分析
            3.2.4.1 单花接种鉴定
            3.2.4.2 自然接种鉴定
            3.2.4.3 毒素测定
    3.3 转基因株系CZI，SZP和SYP的分子鉴定及其赤霉病抗性分析
        3.3.1 转基因株系CZI的获得与分子鉴定
            3.3.1.1 pUPL-HvChi CWP2 载体构建
            3.3.1.2 最小表达框的制备与小麦遗传转化
            3.3.1.3 转基因株系CZI的PCR鉴定与Southern blot分析
        3.3.2 转基因株系SZP和SYP的分子鉴定
        3.3.3 转基因株系CZI，SZP和SYP的赤霉病抗性鉴定
            3.3.3.1 转基因株系SYP的苗期接种鉴定
            3.3.3.2 转基因株系CZI，SZP和SYP的单花接种鉴定
    3.4 以禾谷镰刀菌Chs3b基因为靶标的HIGS技术提高小麦抗赤霉病的研究 .. 63
        3.4.1 转Chs3bRNAi基因小麦的获得
            3.4.1.1 Chs3bRNAi-1，-3 和 -5 最小表达框的制备
            3.4.1.2 转Chs3bRNAi基因小麦的遗传转化过程
        3.4.2 转Chs3bRNAi基因小麦的分子鉴定
            3.4.2.1 PCR鉴定
            3.4.2.2 Southern blot分析
        3.4.3 转Chs3bRNAi基因小麦的赤霉病抗性鉴定
            3.4.3.1 苗期接种鉴定
            3.4.3.2 单花接种鉴定
            3.4.3.3 自然接种鉴定
            3.4.3.4 毒素测定
        3.4.4 转Chs3bRNAi基因小麦的siRNA分子检测
        3.4.5 Fg接种转Chs3bRNAi基因小麦后Chs3b的表达水平分析
        3.4.6 转Chs3bRNAi基因小麦的白粉病抗性鉴定
4 讨论
    4.1 最小表达框法转化小麦的遗传与表达规律分析
        4.1.1 转基因的遗传稳定性
        4.1.2 转基因的沉默现象
    4.2 启动子在植物基因工程中的应用
        4.2.1 Lem2 启动子驱动的Ech42CWP2 基因提高小麦赤霉病抗性
        4.2.2 不同类型启动子在植物基因工程中的应用与展望
    4.3 HIGS技术在防治植物真菌病害中的应用
        4.3.1 针对Fg的Chs3b基因为靶标的HIGS技术提高小麦赤霉病抗性
        4.3.2 HIGS技术在防治植物真菌病害中的应用前景
    4.4 植物抗病转基因育种的展望
        4.4.1 充分挖掘和利用新的抗病基因资源
        4.4.2 分离与克隆不同类型的启动子
        4.4.3 创新与优化小麦遗传转化体系
        4.4.4 抗病转基因新技术新方法的创制
参考文献
附录：攻读博士学位期间发表论文与专利申请情况
致谢



本文编号：3769639