小麦田菵草（Beckmannia syzigachne）对精噁唑禾草灵的代谢抗性研究
发布时间：2023-04-02 14:54
菵草(Beckmannia syzigachne)是一种常见的禾本科杂草,在长江流域及西南地区的稻麦轮作和稻油轮作田为害小麦和油菜的生产安全。精噁唑禾草灵是防除小麦田菵草等禾本科杂草的常用除草剂,其作用靶标是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase),具有低毒、高效、持效期长等特点。但是由于长期依赖该类除草剂,使得菵草对精噁唑禾草灵逐渐产生了抗药性,在田间推荐剂量下已无法有效防除菵草。甲基二磺隆是防除抗精噁唑禾草灵杂草主要的替代药剂,其作用靶标是乙酰乳酸合成酶(ALS)。但是,部分地区的菵草对甲基二磺隆也产生了抗药性,这类多抗性菵草严重威胁小麦的生产安全。本文对采自安徽的多抗性菵草种群(AH-02)进行靶标抗性研究,并未发现任何已报道的赋予靶标抗性的氨基酸突变位点和突变形式,说明其可能存在非靶标抗性。在此基础上,重点研究该种群的非靶标抗性机理,以期为科学防治麦田多抗性菵草提供理论指导。主要研究结果如下:在整株水平上,对AH-02种群进行抗性初筛试验,分别喷施精噁唑禾草灵(62.1 g a.i.ha-1)和甲基二磺隆(15.75 g a.i.ha-1)的...
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 抗性杂草发生与发展概况
1.2 ACCase与 ALS抑制剂类除草剂
1.2.1 ACCase抑制剂类除草剂及其作用靶标
1.2.1.1 植物的ACCase及其功能
1.2.1.2 ACCase抑制剂类除草剂
1.2.2 ALS抑制剂类除草剂及其作用靶标
1.2.2.1 植物的ALS及其功能
1.2.2.2 ALS抑制剂类除草剂
1.3 杂草抗药性产生的学说
1.4 杂草对除草剂的抗性机理
1.4.1 杂草对除草剂的靶标抗性机理
1.4.1.1 ACCase抑制剂类除草剂靶标抗性机理与交互抗性
1.4.1.2 ALS抑制剂类除草剂靶标抗性机理与交互抗性
1.4.2 杂草对除草剂非靶标抗性机理
1.4.2.1 杂草对除草剂的代谢抗性机理
1.4.2.2 非靶标抗性杂草抗性谱分析
1.5 抗药性杂草检测方法
1.6 新一代测序技术的应用
1.7 二穗短柄草的简介
1.8 本研究的目的和意义
1.9 技术路线图
2 材料与方法
2.1 供试材料
2.1.1 供试菵草种群信息
2.1.2 供试菵草种子的萌发及培养条件
2.2 遗传背景一致的菵草的分离和鉴定
2.2.1 田间菵草种群对精噁唑禾草灵和甲基二磺隆抗性测定
2.2.1.1 主要试剂与仪器
2.2.1.2 施药方法
2.2.1.3 单剂量抗性鉴定
2.2.2 抗、敏型菵草ACCase和 ALS基因片段差异性分析
2.2.2.1 供试试剂
2.2.2.2 主要仪器设备
2.2.2.3 菵草基因组DNA提取
2.2.2.4 菵草ACCase和 ALS基因片段克隆
2.2.2.5 目的基因条带的回收
2.2.2.6 目的片段的连接、转化和测序
2.3 F1 代菵草P450s活性差异研究
2.3.1 主要试剂与仪器
2.3.2 P450s抑制剂对杂草抗性水平的影响
2.3.3 数据处理
2.4 F1 代菵草抗性谱测定
2.4.1 供试除草剂
2.4.2 菵草抗性水平测定
2.5 F2 代菵草代谢基因的挖掘
2.5.1 F2 代菵草的获得
2.5.2 转录组测序材料的处理
2.5.3 菵草叶片总RNA的提取
2.5.4 转录组测序及数据分析
2.5.4.1 cDNA文库的构建与测序
2.5.4.2 基因功能注释、分类和代谢途径分析
2.5.4.3 基因差异表达分析
2.5.4.4 菵草代谢抗性相关的差异基因的分析
2.6 菵草代谢抗性相关差异基因的表达验证
2.6.1 供试试剂
2.6.2 RNA的提取
2.6.3 候选差异基因序列的获得
2.6.4 qRT-PCR引物设计
2.6.5 qRT-PCR反应体系及程序
2.7 菵草代谢抗性相关基因的功能验证
2.7.1 供试材料与试剂
2.7.2 菵草GSTU17 差异基因的获得
2.7.2.1 GSTU17 基因引物的设计与合成
2.7.2.2 GSTU17 基因的生物信息学分析
2.7.2.3 GSTU17 基因的克隆
2.7.2.4 GSTU17 基因质粒的获得
2.7.3 菵草GT73C1 差异基因的获得
2.7.3.1 GT73C1 基因引物的设计与合成
2.7.3.2 GT73C1 基因的生物信息学分析
2.7.3.3 GT73C1 基因的克隆
2.7.3.4 GT73C1 基因质粒的获得
2.7.4 植物表达载体的构建
2.7.5 根癌农杆菌EHA105 感受态细胞的转化
2.7.6 二穗短柄草的遗传转化
2.7.6.1 二穗短柄草的萌发及培养条件
2.7.6.2 二穗短柄草愈伤组织的诱导
2.7.6.3 二穗短柄草的侵染
2.7.6.4 二穗短柄草的共培养
2.7.6.5 二穗短柄草的筛选
2.7.6.6 二穗短柄草的分化
2.7.6.7 二穗短柄草的生根
2.7.6.8 二穗短柄草的移栽
2.7.7 转基因二穗短柄草的RT-PCR鉴定
2.7.8 转基因二穗短柄草对精噁唑禾草灵敏感性测定
2.7.9 转基因二穗短柄草目的基因表达量验证
3 结果与分析
3.1 田间菵草种群抗性测定
3.2 菵草ACCase和 ALS基因片段差异性研究
3.2.1 菵草质体型ACCase基因序列差异分析
3.2.2 菵草ALS基因序列差异分析
3.3 F1 菵草P450s酶活性差异分析
3.4 F1 代菵草抗性谱分析
3.5 F2 代菵草代谢基因的筛选
3.5.1 转录组测序数据的质量评估
3.5.2 转录组测序与序列组装
3.5.3 Unigenes的功能注释、分类和代谢途径分析
3.5.3.1 Unigenes的序列相似性分析
3.5.3.2 Unigenes的 GO分类
3.5.3.3 Unigenes的 KOG功能分类
3.5.3.4 Unigenes的 KEGG代谢途径分析
3.5.4 差异基因分析
3.5.5 差异基因的功能注释
3.5.5.1 差异基因的GO富集分析
3.5.5.2 差异基因的KEGG富集分析
3.5.6 菵草代谢抗性相关的差异表达基因的筛选
3.5.7 菵草差异表达基因的qRT-PCR验证
3.6 菵草代谢抗性基因的功能分析
3.6.1 GSTU17 基因的生物信息学分析
3.6.2 GT73C1 基因的生物信息学分析
3.6.3 GSTU17和GT73C1 基因克隆及鉴定
3.6.4 GSTU17和GT73C1 基因植物表达载体的构建
3.6.5 转基因二穗短柄草的筛选及鉴定
3.6.6 转基因二穗短柄草敏感性测定
3.6.7 转基因二穗短柄草q RT-PCR验证
4 讨论
4.1 遗传背景一致的菵草材料的分离
4.2 代谢抗性菵草F1 代的背景研究
4.3 转录组测序技术在杂草抗性机理研究中的应用
4.3.1 杂草代谢抗性基因的筛选
4.3.2 菵草转录组测序分析
4.4 菵草代谢抗性相关基因的转基因功能验证
4.4.1 GST家族基因的分析
4.4.2 GT家族基因的分析
4.4.3 转基因二穗短柄草的分析
5 结论
6 论文创新与有待研究之处
7 参考文献
8 致谢
9 攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3779422
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【学位级别】：博士
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符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 抗性杂草发生与发展概况
1.2 ACCase与 ALS抑制剂类除草剂
1.2.1 ACCase抑制剂类除草剂及其作用靶标
1.2.1.1 植物的ACCase及其功能
1.2.1.2 ACCase抑制剂类除草剂
1.2.2 ALS抑制剂类除草剂及其作用靶标
1.2.2.1 植物的ALS及其功能
1.2.2.2 ALS抑制剂类除草剂
1.3 杂草抗药性产生的学说
1.4 杂草对除草剂的抗性机理
1.4.1 杂草对除草剂的靶标抗性机理
1.4.1.1 ACCase抑制剂类除草剂靶标抗性机理与交互抗性
1.4.1.2 ALS抑制剂类除草剂靶标抗性机理与交互抗性
1.4.2 杂草对除草剂非靶标抗性机理
1.4.2.1 杂草对除草剂的代谢抗性机理
1.4.2.2 非靶标抗性杂草抗性谱分析
1.5 抗药性杂草检测方法
1.6 新一代测序技术的应用
1.7 二穗短柄草的简介
1.8 本研究的目的和意义
1.9 技术路线图
2 材料与方法
2.1 供试材料
2.1.1 供试菵草种群信息
2.1.2 供试菵草种子的萌发及培养条件
2.2 遗传背景一致的菵草的分离和鉴定
2.2.1 田间菵草种群对精噁唑禾草灵和甲基二磺隆抗性测定
2.2.1.1 主要试剂与仪器
2.2.1.2 施药方法
2.2.1.3 单剂量抗性鉴定
2.2.2 抗、敏型菵草ACCase和 ALS基因片段差异性分析
2.2.2.1 供试试剂
2.2.2.2 主要仪器设备
2.2.2.3 菵草基因组DNA提取
2.2.2.4 菵草ACCase和 ALS基因片段克隆
2.2.2.5 目的基因条带的回收
2.2.2.6 目的片段的连接、转化和测序
2.3 F1 代菵草P450s活性差异研究
2.3.1 主要试剂与仪器
2.3.2 P450s抑制剂对杂草抗性水平的影响
2.3.3 数据处理
2.4 F1 代菵草抗性谱测定
2.4.1 供试除草剂
2.4.2 菵草抗性水平测定
2.5 F2 代菵草代谢基因的挖掘
2.5.1 F2 代菵草的获得
2.5.2 转录组测序材料的处理
2.5.3 菵草叶片总RNA的提取
2.5.4 转录组测序及数据分析
2.5.4.1 cDNA文库的构建与测序
2.5.4.2 基因功能注释、分类和代谢途径分析
2.5.4.3 基因差异表达分析
2.5.4.4 菵草代谢抗性相关的差异基因的分析
2.6 菵草代谢抗性相关差异基因的表达验证
2.6.1 供试试剂
2.6.2 RNA的提取
2.6.3 候选差异基因序列的获得
2.6.4 qRT-PCR引物设计
2.6.5 qRT-PCR反应体系及程序
2.7 菵草代谢抗性相关基因的功能验证
2.7.1 供试材料与试剂
2.7.2 菵草GSTU17 差异基因的获得
2.7.2.1 GSTU17 基因引物的设计与合成
2.7.2.2 GSTU17 基因的生物信息学分析
2.7.2.3 GSTU17 基因的克隆
2.7.2.4 GSTU17 基因质粒的获得
2.7.3 菵草GT73C1 差异基因的获得
2.7.3.1 GT73C1 基因引物的设计与合成
2.7.3.2 GT73C1 基因的生物信息学分析
2.7.3.3 GT73C1 基因的克隆
2.7.3.4 GT73C1 基因质粒的获得
2.7.4 植物表达载体的构建
2.7.5 根癌农杆菌EHA105 感受态细胞的转化
2.7.6 二穗短柄草的遗传转化
2.7.6.1 二穗短柄草的萌发及培养条件
2.7.6.2 二穗短柄草愈伤组织的诱导
2.7.6.3 二穗短柄草的侵染
2.7.6.4 二穗短柄草的共培养
2.7.6.5 二穗短柄草的筛选
2.7.6.6 二穗短柄草的分化
2.7.6.7 二穗短柄草的生根
2.7.6.8 二穗短柄草的移栽
2.7.7 转基因二穗短柄草的RT-PCR鉴定
2.7.8 转基因二穗短柄草对精噁唑禾草灵敏感性测定
2.7.9 转基因二穗短柄草目的基因表达量验证
3 结果与分析
3.1 田间菵草种群抗性测定
3.2 菵草ACCase和 ALS基因片段差异性研究
3.2.1 菵草质体型ACCase基因序列差异分析
3.2.2 菵草ALS基因序列差异分析
3.3 F1 菵草P450s酶活性差异分析
3.4 F1 代菵草抗性谱分析
3.5 F2 代菵草代谢基因的筛选
3.5.1 转录组测序数据的质量评估
3.5.2 转录组测序与序列组装
3.5.3 Unigenes的功能注释、分类和代谢途径分析
3.5.3.1 Unigenes的序列相似性分析
3.5.3.2 Unigenes的 GO分类
3.5.3.3 Unigenes的 KOG功能分类
3.5.3.4 Unigenes的 KEGG代谢途径分析
3.5.4 差异基因分析
3.5.5 差异基因的功能注释
3.5.5.1 差异基因的GO富集分析
3.5.5.2 差异基因的KEGG富集分析
3.5.6 菵草代谢抗性相关的差异表达基因的筛选
3.5.7 菵草差异表达基因的qRT-PCR验证
3.6 菵草代谢抗性基因的功能分析
3.6.1 GSTU17 基因的生物信息学分析
3.6.2 GT73C1 基因的生物信息学分析
3.6.3 GSTU17和GT73C1 基因克隆及鉴定
3.6.4 GSTU17和GT73C1 基因植物表达载体的构建
3.6.5 转基因二穗短柄草的筛选及鉴定
3.6.6 转基因二穗短柄草敏感性测定
3.6.7 转基因二穗短柄草q RT-PCR验证
4 讨论
4.1 遗传背景一致的菵草材料的分离
4.2 代谢抗性菵草F1 代的背景研究
4.3 转录组测序技术在杂草抗性机理研究中的应用
4.3.1 杂草代谢抗性基因的筛选
4.3.2 菵草转录组测序分析
4.4 菵草代谢抗性相关基因的转基因功能验证
4.4.1 GST家族基因的分析
4.4.2 GT家族基因的分析
4.4.3 转基因二穗短柄草的分析
5 结论
6 论文创新与有待研究之处
7 参考文献
8 致谢
9 攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3779422
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