鸡内源性反转录病毒ALVE1的天然免疫功能及分子机制
发布时间：2023-06-01 19:19
DNA甲基化抑制剂5-Aza-2’-Deoxycytidine(5-Aza-dC)是第一个被美国FDA批准,用于治疗人类急性粒细胞白血病的表观修饰药物之一,它能与DNA甲基转移酶DNMT竞争性结合抑制其活性,阻断抑癌基因DNA甲基化反应,是广谱抗肿瘤药物。最新研究表明,在结肠癌和卵巢癌中,5-Aza-dC可激活内源性反转录病毒(ERV)来诱导Ⅰ型干扰素反应,进而发挥抗肿瘤作用。禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)诱发的慢性传染性肿瘤病,对家禽业危害巨大。禽白血病的防治,一直是困扰家禽业的世界性难题。本研究发现,DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC同样具有激活内源性反转录病毒进而抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。由于ERV大多因为突变、缺失而失去编码蛋白的能力,是体内重要的长非编码RNA来源。那么,5-Aza-dC是否通过诱导ERV产生的长非编码RNA来发挥抗肿瘤抗病毒的功能呢?基于以上科学问题,主要研究内容如下:(1)DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC具有抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。本研究先用禽白血病病毒ALVJ感染鸡胚成纤维细胞CEF 24 h,再通过5 μM 5-Aza-dC处理感染...
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号说明
第一章 文献综述
1 内源性反转录病毒研究进展
1.1 内源性反转录病毒概述
1.2 内源性反转录病毒作用机制
1.3 内源性反转录病毒的天然免疫功能
2 长链非编码RNA研究进展
2.1 长链非编码RNA概述
2.2 长链非编码RNA作用机制
2.3 长链非编码RNA的天然免疫功能
3 DNA甲基转移酶抑制剂研究进展
3.1 DNA甲基转移酶抑制剂概述
3.2 DNA甲基转移酶抑制剂对基因表达的影响
4 研究目的和意义
第二章 DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC激活鸡内源性反转录病毒并抑制ALVJ感染
1 前言
2 材料
2.1 细胞与病毒
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
3 方法
3.1 鸡胚成纤维细胞的制备
3.2 5-Aza-dC处理鸡胚成纤维细胞
3.3 共聚焦间接免疫荧光试验
3.4 总蛋白提取
3.5 Western blot
3.6 总RNA提取
3.7 转录组测序
3.8 cDNA合成和qRT-PCR
4 结果与分析
4.1 5-Aza-dC处理鸡胚成纤维细胞浓度筛选
4.2 5-Aza-dC抑制J亚群禽白血病病毒增殖和入侵
4.3 RNA-Seq测序数据与质量评估
4.4 RNA-Seq结果验证
4.5 去甲基化试剂5-Aza-dC激活天然免疫相关基因表达
4.6 去甲基化试剂5-Aza-dC激活鸡内源性反转录病毒表达
5 讨论
第三章 源于鸡内源性反转录病毒ALVE1的lnc-ALVE1-AS1的鉴定
1 前言
2 材料
2.1 细胞与载体
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
3 方法
3.1 总RNA提取及纯化
3.2 RACE快速扩增转录子两端序列
3.3 Northerblot试验
3.4 生物信息学分析
3.5 RNA FISH试验
3.6 转录子编码蛋白能力验证
3.7 细胞转染
3.8 Westernbolt
4 结果与分析
4.1 5'RACE和3'RACE鉴定转录子全长
4.2 Northern blot鉴定转录子
4.3 生物信息学预测转录子编码能力和二级结构
4.4 体外实验验证转录子编码能力
4.5 RNA FISH鉴定lnc-ALVE1-AS1亚细胞定位
5 讨论
第四章 长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的天然免疫功能及分子机制
1 前言
2 材料
2.1 细胞、载体与病毒
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
3 方法
3.1 lnc-ALVE1-AS1过表达载体构建
3.2 细胞转染
3.3 qRT-PCR
3.4 lnc-ALVE1-AS1 RNAi干扰试验
3.5 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
3.6 共聚焦免疫荧光
3.7 RNA Pulldown
3.8 WesternBlot
3.9 RNA FISH
3.10 TLR3干扰试验
3.11 TLR3信号抑制试验
4 结果与分析
4.1 lnc-ALVE1-AS1过表达重组质粒的构建
4.2 lnc-ALVE1-AS1激活I型干扰素信号转录因子表达
4.3 干扰lnc-ALVE1-AS1抑制干扰素刺激基因表达
4.4 lnc-ALVE1-AS1抑制禽白血病病毒ALVJ增殖
4.5 lnc-ALVE1-AS1影响胞内核酸识别因子的表达水平
4.6 TLR3是lnc-ALVE1-AS1发挥天然免疫抗病毒反应的核酸识别因子
5 讨论
全文结论
主要创新点
进一步研究展望
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
本文编号：3826888
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【学位级别】：博士
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第一章 文献综述
1 内源性反转录病毒研究进展
1.1 内源性反转录病毒概述
1.2 内源性反转录病毒作用机制
1.3 内源性反转录病毒的天然免疫功能
2 长链非编码RNA研究进展
2.1 长链非编码RNA概述
2.2 长链非编码RNA作用机制
2.3 长链非编码RNA的天然免疫功能
3 DNA甲基转移酶抑制剂研究进展
3.1 DNA甲基转移酶抑制剂概述
3.2 DNA甲基转移酶抑制剂对基因表达的影响
4 研究目的和意义
第二章 DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC激活鸡内源性反转录病毒并抑制ALVJ感染
1 前言
2 材料
2.1 细胞与病毒
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
3 方法
3.1 鸡胚成纤维细胞的制备
3.2 5-Aza-dC处理鸡胚成纤维细胞
3.3 共聚焦间接免疫荧光试验
3.4 总蛋白提取
3.5 Western blot
3.6 总RNA提取
3.7 转录组测序
3.8 cDNA合成和qRT-PCR
4 结果与分析
4.1 5-Aza-dC处理鸡胚成纤维细胞浓度筛选
4.2 5-Aza-dC抑制J亚群禽白血病病毒增殖和入侵
4.3 RNA-Seq测序数据与质量评估
4.4 RNA-Seq结果验证
4.5 去甲基化试剂5-Aza-dC激活天然免疫相关基因表达
4.6 去甲基化试剂5-Aza-dC激活鸡内源性反转录病毒表达
5 讨论
第三章 源于鸡内源性反转录病毒ALVE1的lnc-ALVE1-AS1的鉴定
1 前言
2 材料
2.1 细胞与载体
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
3 方法
3.1 总RNA提取及纯化
3.2 RACE快速扩增转录子两端序列
3.3 Northerblot试验
3.4 生物信息学分析
3.5 RNA FISH试验
3.6 转录子编码蛋白能力验证
3.7 细胞转染
3.8 Westernbolt
4 结果与分析
4.1 5'RACE和3'RACE鉴定转录子全长
4.2 Northern blot鉴定转录子
4.3 生物信息学预测转录子编码能力和二级结构
4.4 体外实验验证转录子编码能力
4.5 RNA FISH鉴定lnc-ALVE1-AS1亚细胞定位
5 讨论
第四章 长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的天然免疫功能及分子机制
1 前言
2 材料
2.1 细胞、载体与病毒
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
3 方法
3.1 lnc-ALVE1-AS1过表达载体构建
3.2 细胞转染
3.3 qRT-PCR
3.4 lnc-ALVE1-AS1 RNAi干扰试验
3.5 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
3.6 共聚焦免疫荧光
3.7 RNA Pulldown
3.8 WesternBlot
3.9 RNA FISH
3.10 TLR3干扰试验
3.11 TLR3信号抑制试验
4 结果与分析
4.1 lnc-ALVE1-AS1过表达重组质粒的构建
4.2 lnc-ALVE1-AS1激活I型干扰素信号转录因子表达
4.3 干扰lnc-ALVE1-AS1抑制干扰素刺激基因表达
4.4 lnc-ALVE1-AS1抑制禽白血病病毒ALVJ增殖
4.5 lnc-ALVE1-AS1影响胞内核酸识别因子的表达水平
4.6 TLR3是lnc-ALVE1-AS1发挥天然免疫抗病毒反应的核酸识别因子
5 讨论
全文结论
主要创新点
进一步研究展望
参考文献
附录
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本文编号：3826888
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