OsCUL3a介导的水稻细胞死亡和广谱抗病性研究

发布时间：2023-06-04 01:36

　　揭示水稻抗病与生长的协调机制,培育具有广谱抗病性的水稻品种对于水稻的稳产和增产具有重要现实意义。本研究主要利用蛋白质组学与基因编辑等技术,从表型、生理生化、亚细胞结构、代谢途径、蛋白互作等不同层面,对OsCUL3a协调抗病与生长,特别是与重要免疫相关基因OsNPR1/2/3在控制细胞死亡方面的关系进行研究。本文主要研究结果如下:1.利用体视显微镜观察发现oscul3a突变体类病斑的形成可能由叶片局部组织区域的H2O2积累和细胞死亡产生,然后逐渐扩展到整片叶片;不同时期水稻叶片DAB染色发现,相比野生型ZH11,oscul3a突变体叶片在50 DPS开始H2O2积累,在60 DPS时H2O2积累表型非常明显。这种动态的生理变化,使oscul3a突变体对稻瘟病和白叶枯病具有广谱抗病性,使其在生长后期的抗病性会显著提高。2.相比野生型ZH11和转基因互补材料p1300-OsCUL3a-1和p1300-OsCUL3a-2,oscul3a突变体的生长速率在35 DPS-55 DPS阶段相对较慢,与oscul3a突变体H2O2的动态积累和细胞死亡表型出现阶段的细胞生理条件变化有关,最后导致oscu...

【文章页数】：109 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 植物类病斑形成机制
        1.1.1 光温反应与细胞器功能
        1.1.2 激素水平与细胞代谢
    1.2 泛素化修饰与细胞死亡和抗病性
        1.2.1 植物泛素蛋白酶体途径及其生物学功能
        1.2.2 CRL3类E3泛素连接酶的生物学功能
        1.2.3 植物泛素化修饰与抗病性
    1.3 蛋白质组学技术在类病斑形成机制中的应用
    1.4 本研究的目的和意义
第二章 oscul3a突变体的类病斑表型分析与抗病性鉴定
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验方法
            2.1.2.1 农艺性状考察
            2.1.2.2 叶片DAB染色
            2.1.2.3 透射电镜观察
            3.1.2.4 扫描电镜观察
            3.1.2.5 稻米品质分析
            2.1.2.6 稻瘟病接种鉴定
            2.1.2.7 白叶枯病接种鉴定
    2.2 结果与分析
        2.2.1 oscul3a突变体类病斑表型与生长的关系
        2.2.2 oscul3a突变体的稻米扫描电镜观察与品质分析
        2.2.3 oscul3a突变体具有稻瘟病和白叶枯病抗性
        2.2.4 oscul3a突变体的亚细胞观察
    2.3 小结与讨论
        2.3.1 oscul3a突变体具有动态的ROS积累和细胞死亡
        2.3.2 oscul3a突变体生长抑制与ROS积累和细胞死亡有关
        2.3.3 oscul3a突变体抗病性的提高与ROS积累和细胞死亡有关
        2.3.4 环境条件对oscul3a突变体类病斑形成的影响
        2.3.5 不同ROS积累和细胞死亡程度对类病斑材料抗病性的影响
第三章 oscul3a突变体的蛋白质组学分析及其信号网络
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
            3.1.1.1 植物材料
            3.1.1.2 化学试剂
        3.1.2 实验方法
            3.1.2.1 蛋白质组检测样品准备
            3.1.2.2 TMT标记质谱检测
            3.1.2.3 PRM靶向检测
            3.1.2.4 差异表达蛋白功能分析
            3.1.2.5 差异表达蛋白的网络分析
            3.1.2.6 叶片DAB染色
            3.1.2.7 叶片SA含量检测
            3.1.2.8 香豆素的抗病性鉴定
            3.1.2.9 香豆素处理水稻愈伤
    3.2 结果与分析
        3.2.1 oscul3a突变体差异表达蛋白的功能分析
        3.2.2 oscul3a突变体代谢途径的差异分析
        3.2.3 OsCUL3a互作蛋白与分子开关分析
        3.2.4 OsCUL3a靶标蛋白的定量分析
        3.2.5 香豆素抑制水稻稻瘟病菌的生长
    3.3 小结与讨论
        3.3.1 oscul3a突变体的类病斑表型与细胞代谢平衡
        3.3.2 OsCUL3a与分子开关蛋白的互作联系
        3.3.3 oscul3a突变体的类病斑与铁死亡(ferroptosis)机制
        3.3.4 oscul3a突变体的类病斑与苯丙烷类(phenyloropanoid)代谢途径
第四章 OsNPR1/2/3在OsCUL3a介导水稻细胞死亡中的作用
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验方法
            4.1.2.1 叶片DAB染色
            4.1.2.2 酵母双杂交验证
            4.1.2.3 CRISPR-Cas9 载体构建
            4.1.2.4 质粒的农杆菌转化
            4.1.2.5 水稻的遗传转化
            4.1.2.6 潮霉素抗性鉴定
            4.1.2.7 敲除材料的测序鉴定
            4.1.2.8 敲除基因的功能分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 OsCUL3a-KO敲除材料具有类病斑表型
        4.2.2 ZH11、oscul3a、p1300-OsCUL3a-1/2和oscul3a/osnpr1 表型观察
        4.2.3 oscul3a/osnpr2和oscul3a/osnpr3 的表型差异
        4.2.4 水稻OsNPR1/2/3的功能分析
    4.3 小结与讨论
        4.3.1 OsNPR1/2和OsNPR3 具有相反的细胞死亡作用机制
        4.3.2 水稻OsNPR1/2/3 和拟南芥AtNPR1/3/4 的结构差异
        4.3.3 OsCUL3a协调水稻生长、细胞死亡与抗病性的探讨
第五章 全文结论和创新点
参考文献
附录
致谢
作者简历



本文编号：3830432