let-7 microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制

发布时间：2024-05-28 19:51

　　家蚕是由野桑蚕驯化而来的重要的经济昆虫,通过对丝蛋白基因表达调控、丝蛋白组装机制、丝腺生长发育机理的研究,有望在提高蚕丝产量、获得特殊性能蚕丝纤维、拓展丝腺生物反应器应用等方面取得突破。let-7是一个极其保守的microRNA(miRNA),在不同物种中都以let-7簇(let-7 cluster,let-7C)的形式存在,在时序性发育、肿瘤的发生与发展、细胞多能性维持等方面发挥重要的转录后调控功能,但let-7在家蚕丝腺中的功能目前尚不清楚。本研究利用基因编辑手段,在丝腺的不同部位实现let-7和let-7C敲除,验证了它们对中部丝腺和后部丝腺生长的影响;利用转录组测序探索了let-7调控丝腺生长的分子机理;筛选得到let-7调控丝腺生长的靶基因,并对靶基因功能进行了研究。研究结果如下:1.家蚕丝腺miRNA研究方法探索为研究丝腺中miRNA的功能,我们试用不同方法来改变miRNA在丝腺中的表达量,以找到最适合丝腺miRNA功能研究的方法。首先以丝腺特异性表达的miR-274为研究对象,合成miR-274 mimic和miR-274 antagomir,注射到家蚕五龄幼虫体内,但它...

【文章页数】：158 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 概述
    1.2 丝腺发育与丝蛋白表达调控
        1.2.1 丝腺发育
        1.2.2 丝蛋白合成与分泌
    1.3 非编码RNA研究进展
        1.3.1 非编码RNA分类及主要功能
        1.3.2 miRNA的产生与作用机制
        1.3.3 miRNA Cluster
        1.3.4 家蚕非编码RNA研究进展
    1.4 let-7 研究进展
        1.4.1 let-7 在发育中的调控作用
        1.4.2 let-7 在癌症中的调控作用
        1.4.3 let-7 在细胞周期调控中的作用
    1.5 miRNA功能研究方法
        1.5.1 基于大数据的miRNA研究方法
        1.5.2 基于化学合成和转基因技术的miRNA研究方法
        1.5.3 基于基因编辑技术的miRNA研究方法
第二章 引言
    2.1 研究目的与意义
    2.2 科学问题及主要研究内容
    2.3 技术路线
第三章 家蚕丝腺miRNA研究方法探索
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要仪器与试剂
        3.1.3 实验方法与步骤
    3.2 结果与分析
        3.2.1 功能试剂注射及效果检测
        3.2.2 miR-274 sponge特异性下调miR-274
        3.2.3 miR-274转基因过表达
        3.2.4 利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除miR-274
    3.3 总结与讨论
第四章 家蚕let-7C miRNA抑制家蚕细胞增殖
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 主要仪器与试剂
        4.1.3 实验方法与步骤
    4.2 结果与分析
        4.2.1 let-7C miRNAs的在不同发育时期的家蚕个体和组织中的表达谱分析
        4.2.2 let-7C miRNAs在五龄幼虫丝腺中的时序表达
        4.2.3 let-7C miRNAs对家蚕Bm E细胞增殖的影响
        4.2.4 let-7C miRNAs对家蚕Bm Ns细胞增殖的影响
    4.3 总结与讨论
第五章 let-7C miRNA敲除对中部丝腺生长的影响
    5.1 材料与方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 主要仪器与试剂
        5.1.3 实验方法与步骤
    5.2 结果与分析
        5.2.1 敲除let-7和let-7C双gRNA表达品系
        5.2.2 中部丝腺let-7和let-7C敲除个体
        5.2.3 let-7及let-7C敲除促进中部丝腺生长
        5.2.4 中部丝腺敲除let-7和let-7C后的表型差异
        5.2.5 中部丝腺敲除let-7和let-7C对家蚕吐丝的影响
    5.3 总结与讨论
第六章 let-7C miRNA对后部丝腺生长的影响
    6.1 材料与方法
        6.1.1 材料
        6.1.2 主要仪器与试剂
        6.1.3 实验方法与步骤
    6.2 结果与分析
        6.2.1 let-7和let-7C后部丝腺敲除个体获取
        6.2.2 let-7 敲除对后部丝腺生长的影响
        6.2.3 let-7C敲除对后部丝腺生长的影响
        6.2.4 敲除后部丝腺let-7和let-7C产生的表型差异
        6.2.5 let-7和let-7C敲除促进后部丝腺细胞核内复制
        6.2.6 过表达let-7C miRNA对丝腺生长的影响
    6.3 总结与讨论
第七章 let-7 调控丝腺生长的分子机理初探
    7.1 材料与方法
        7.1.1 材料
        7.1.2 主要仪器与试剂
        7.1.3 实验方法与步骤
    7.2 结果与分析
        7.2.1 丝腺RNA提取及质量检测
        7.2.2 测序数据质量评估
        7.2.3 基因表达分析
        7.2.4 差异表达基因聚类分析
        7.2.5 差异表达基因GO和 Pathway富集分析
    7.3 总结与讨论
第八章 let-7 靶基因鉴定及功能研究
    8.1 材料与方法
        8.1.1 材料
        8.1.2 主要仪器与试剂
        8.1.3 实验方法与步骤
    8.2 结果与分析
        8.2.1 let-7 靶基因预测
        8.2.2 let-7 表型相关靶基因筛选
        8.2.3 表型相关靶基因表达分析、3’UTR及双荧光素酶报告系统
        8.2.4 let-7 靶基因验证
        8.2.5 靶位点有效性验证
        8.2.6 过表达PC对丝腺生长的影响
        8.2.7 敲除PC对丝腺生长的影响
    8.3 总结与讨论
第九章 综合与结论
论文创新点
参考文献
附录
发表文章和参研课题
致谢



本文编号：3983644