母乳婴儿源益生菌筛选及其干预炎症性肠病的免疫效应和相关机制研究

发布时间：2023-03-07 20:45

　　生命早期是肠道微生物群正确建立的关键时期,肠道菌群的早期定植又直接影响着婴儿免疫系统的发育和成熟,进而对机体健康产生短期,中期甚至是长期的影响。在这一生命阶段,母婴垂直传播在新生儿肠道微生物初始定植中发挥关键作用,而在众多传播途径中:羊水、阴道、空腔、皮肤、母乳等,尤以母乳喂养最为主要。乳酸菌,作为人体肠道菌群中一类重要的益生菌,与宿主的健康密切相关:某些特定的菌株已被证明具有免疫调节、缓解氧化应激、抑制炎症性肠病等功能,并且有报道认为:机体和肠道微生物之间具有特异性的相互选择关系:当菌株的来源和其应用到对象保持一致时,就会显著增强菌株对机体益生功能的特异性和有效性,即:最理想的益生菌最好是来源于人体本身。本研究采集纯母乳喂养婴儿新鲜粪便,从中分离出一系列乳酸菌株,并以抗人工消化液能力、耐胆盐能力、黏附能力等为指标,筛选出一株具有潜在益生功能的乳酸菌,通过对其16S rRNA进行测序并结合生理生化试验结果初步确定为植物乳杆菌,命名BF₁5,同时通过体外试验对该菌株的安全性(抗生素敏感性、有害代谢产物、溶血性等)及益生功能(免疫调节、抗氧化能力)进行了初步评估;进一...

【文章页数】：158 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1 文献综述
        1.1 母乳婴儿源益生菌
            1.1.1 通过母乳喂养母亲肠道菌群在母亲-新生儿之间的垂直转移
            1.1.2 益生菌与婴儿健康
            1.1.3 母乳婴儿源益生菌的国内外研究进展
        1.2 益生菌与肠道性疾病:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)
            1.2.1 肠道稳态维持免疫机制
            1.2.2 炎症性肠病中肠道菌群与宿主免疫反应的影响因素
            1.2.3 针对IBD肠道菌群的潜在治疗方案
            1.2.4 益生菌对溃疡性结肠炎的保护机制
            1.2.5 组学在炎症性肠病中的应用
            1.2.6 益生菌缓解溃疡性结肠炎及其作用机制的国内外研究进展
    2 本研究的目的意义、研究内容及技术路线
        2.1 研究的目的及意义
        2.2 研究内容
        2.3 技术路线
    3 本研究预期创新点
第二章 母乳婴儿源益生菌的筛选及初步评价
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 样品来源及采集标准
            1.1.2 菌株来源
            1.1.3 主要试剂
            1.1.4 主要仪器与设备
            1.1.5 主要培养基的配制
        1.2 试验方法
            1.2.1 样本采集
            1.2.2 乳酸菌的分离、纯化及保藏
            1.2.3 具有潜在益生特性乳酸菌的筛选
            1.2.4 菌株的鉴定
            1.2.5 菌株体外安全性评价
            1.2.6 菌株体外益生特性评价
        1.3 数据处理
    2 结果与分析
        2.1 菌株的筛选
            2.1.1 耐酸菌株的筛选
            2.1.2 菌株对人工消化液耐受性
            2.1.3 菌株对胆盐的耐受性
            2.1.4 菌株对Caco-2细胞的黏附性能
        2.2 菌株BF₁5的鉴定
            2.2.1 BF₁5的菌落、菌体形态及生理生化特性
            2.2.2 BF₁5的16S rRNA基因序列分析
        2.3 菌株BF₁5的安全性评价
            2.3.1 药敏试验
            2.3.2 质粒验证
            2.3.3 有害代谢产物
            2.3.4 溶血试验
        2.4 菌株BF₁5体外益生功能评价
            2.4.1 BF₁5体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响
            2.4.2 菌株H₂O₂耐受能力
            2.4.3 BF₁5体外抗氧化能力评价
    3 讨论
        3.1 益生菌的初筛及鉴定
        3.2 菌株BF₁5的体外安全性评价
        3.3 菌株BF₁5的体外益生功能评价
>            3.3.1 BF₁5体外免疫调节能力_</li>
            3.3.2 BF₁5体外抗氧化能力
    本章小结
第三章 母乳婴儿源益生菌:植物乳杆菌BF₁5通过调节肠道菌群缓解环磷酰胺诱发免疫抑制的研究
    第一节 植物乳杆菌BF₁5在小鼠体内的定植能力研究
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
                1.1.1 菌株来源
                1.1.2 试剂及工具酶
                1.1.3 主要仪器与设备
                1.1.4 试验动物
            1.2 试验方法
                1.2.1 菌悬液的制备
                1.2.2 小鼠的饲养及分组
                1.2.3 基因组DNA提取
                1.2.4 细菌rpo B可变区的PCR扩增
                1.2.5 BF₁5肠道定植的检测
        2 结果与分析
            2.1 样品基因组提取及基于rpo B特异性引物的PCR扩增
            2.2 BF₁5在小鼠肠道定植情况的DGGE电泳图谱分析
        3 讨论
    第二节 植物乳杆菌BF₁5通过调节肠道菌群缓解环磷酰胺诱发的小鼠免疫抑制的研究
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
                1.1.1 菌株来源
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器与设备
                1.1.4 试验动物
            1.2 试验方法
                1.2.1 BF₁5对免疫抑制小鼠的调节功能测定
                1.2.2 BF₁5对免疫抑制小鼠肠道菌群影响的测定
            1.3 数据处理
        2 结果与分析
            2.1 BF₁5对免疫抑制小鼠免疫功能的影响
            2.2 BF₁5对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响
                2.2.1 不同处理组样本提取基因组的质量评估
                2.2.2 不同处理组样本高通量测序质量评估
                2.2.3 不同处理组样本肠道菌群分布情况
                2.2.4 不同处理组样本肠道菌群结构组成
                2.2.5 基于picmst 16S测序的肠道菌群功能预测
        3 讨论
            3.1 BF₁5对免疫抑制小鼠的免疫调节能力
            3.2 BF₁5对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响
                3.2.1 对免疫抑制小鼠肠道菌群结构组成的影响
                3.2.2 对肠道微生物群落功能的影响
    本章小结
第四章 母乳婴儿源益生菌:植物乳杆菌BF₁5干预炎症性肠病及其作用机理研究
    第一节 植物乳杆菌BF₁5缓解DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的效应评价
        1 材料与方法
            1.1 材料与试剂
                1.1.1 菌株
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器与设备
                1.1.4 试验动物
            1.2 试验方法
                1.2.1 动物模型的优化
                1.2.2 BF₁5缓解DSS诱导小鼠结肠炎症能力的测定
            1.3 数据处理
        2 结果与分析
            2.1 动物模型的优化
                2.1.1 DAI评分
                2.1.2 结肠长度及组织学损伤的评估
                2.1.3 考马斯亮蓝法测定样品蛋白浓度标准曲线
                2.1.4 氧化应激及能量代谢指标
                2.1.5 血清中炎症因子及sIgA含量的测定
                2.1.6 两组UC模型各指标数据离散度比较
            2.2 BF₁5对DSS诱导小鼠结肠炎症的缓解作用
                2.2.1 DAI评分
                2.2.2 小鼠结肠长度及组织学损伤评价
                2.2.3 氧化应激及能量代谢指标的评价
                2.2.4 炎症因子及sIgA含量的评价
        3 讨论
            3.1 DSS诱导溃疡性结肠炎模型的优化
            3.2 BF₁5缓解DSS诱导UC
                3.2.1 BF₁5对UC小鼠及结肠炎症的缓解
                3.2.2 BF₁5对UC小鼠结肠氧化损伤及能量代谢障碍的影响
                3.2.3 BF₁5对UC小鼠免疫功能的影响
    第二节 植物乳杆菌BF₁5对DSS诱导小鼠肠道菌群紊乱调节的研究
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 主要试剂与仪器
                1.1.2 试验动物
            1.2 方法
                1.2.1 菌悬液的制备
                1.2.2 动物分组
                1.2.3 粪便样品采集
                1.2.4 高通量测序试验流程
                1.2.5 生物信息学分析及数据统计学处理
        2 结果与分析
            2.1 不同处理组样本基因组质量评估
            2.2 不同处理组样本高通量测序质量评估
            2.3 不同处理组肠道菌群分布情况
            2.4 不同处理组小鼠肠道菌群结构组成
            2.5 基于picmst 16s测序的肠道菌群功能预测
        3 讨论
            3.1 BF₁5对肠道微生物群落结构的影响
            3.2 BF₁5对肠道微生物群落功能的影响
    第三节 基于蛋白质组学解析植物乳杆菌BF₁5通过调节肠道菌群缓解溃疡性结肠炎的作用机制研究
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 主要试剂与仪器
                1.1.2 试验动物
            1.2 方法
                1.2.1 菌悬液的制备
                1.2.2 动物分组
                1.2.3 结肠组织的采集
                1.2.4 不同处理组样本差异表达蛋白测序流程
                1.2.5 蛋白质组学的生物信息学分析
        2 结果与分析
            2.1 蛋白定量及质量检测
            2.2 差异蛋白的鉴定与定量
            2.3 差异表达蛋白主成分分析
            2.4 结肠组织中UC差异表达蛋白的生物信息学分析
                2.4.1 GO注释与GO富集分析
                2.4.2 KEGG注释与KEGG富集分析
            2.5 结肠组织中益生菌(BF₁5/LGG)干预UC差异表达蛋白的生物信息学分析
                2.5.1 益生菌(BF₁5/LGG)干预UC差异表达蛋白的GO注释
                2.5.2 益生菌(BF₁5/LGG)干预UC差异表达蛋白的GO富集
                2.5.3 益生菌(BF₁5/LGG)干预UC差异表达蛋白KEGG注释富集分析
            2.6 UC和益生菌(BF₁5/LGG)干预UC小鼠的结肠蛋白质组学联合分析
                2.6.1 结肠组织中UC和益生菌(BF₁5/LGG)干预UC差异表达蛋白联合分析
                2.6.2 结肠组织中UC与益生菌(BF₁5/LGG)干预UC差异表达蛋白KEGG富集通路联合分析
        3 讨论
            3.1 益生菌(BF₁5/LGG)干预UC直接回调蛋白
            3.2 益生菌(BF₁5/LGG)干预UC直接作用的信号通路:抗原的加工与提呈
    本章小结
第五章 结论与展望
参考文献
在校期间发表学术论文
作者简介
致谢



本文编号：3757858