HeLa细胞来源外泌体通过触发内质网应激破坏血管内皮屏障促进肿瘤转移

发布时间：2023-03-09 19:14

　　研究背景肿瘤来源的外泌体能够通过促进肿瘤血管新生、诱导肿瘤相关成纤维细胞的分化、参与肿瘤微环境中的免疫调控促进肿瘤的免疫逃逸、塑造未来转移靶器官的微环境以实现自身转移等多种方式,调控肿瘤微环境,进而促进肿瘤的进展。肿瘤血管生成是肿瘤微环境一个重要的特征,在肿瘤的进展中发挥着关键作用。然而肿瘤在发展过程中在促进血管新生的同时,也同时伴随着原有及新生血管的破坏。外泌体如何破坏血管及其机制目前仍缺乏研究。实验目的本实验拟研究HeLa细胞来源的外泌体对血管内皮细胞高表达的紧密连接蛋白_带状闭合蛋白1(Zona Occludens-1,ZO-1)及封闭蛋白5(Claudin-5,CLDN-5)蛋白表达水平的影响,并探讨其背后的机制。实验方法使用超速离心法超离提纯HeLa细胞分泌的外泌体,并使用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)定量Hela细胞外泌体。采用电镜、免疫印迹法(Western bloting,WB)及粒径分析检测外泌体的特性。分离培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),...

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【学位级别】：博士

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缩略词表
1 引言
2 实验材料
    2.1 实验动物及人体组织标本
    2.2 实验仪器及耗材
    2.3 实验试剂
    2.4 RT-PCR引物列表
    2.5 一抗及二抗列表
3 实验方法
    3.1 人脐静脉内皮细胞的分离培养
    3.2 HELA细胞及人宫颈内膜上皮细胞培养及条件培养基获取
    3.3 细胞外泌体提取
    3.4 外泌体电镜鉴定
    3.5 外泌体PKH26染色及细胞内吞
    3.6 细胞分组及处理
    3.7 细胞增殖能力检测
    3.8 细胞成血管能力检测
    3.9 免疫荧光染色
    3.10 蛋白印记
    3.11 实时荧光定量PCR
    3.12 内皮细胞层通透性检测实验
    3.13 肿瘤细胞穿透内皮细胞层迁移实验
    3.14 经外泌体作用后的HUVEC电镜检测
    3.15 外泌体在体内对动物血管通透性的检测
    3.16 外泌体对肿瘤转移的检测
    3.17 外泌体微小RNA(MIRNA)测序
    3.18 MIRNA测序结果数据分析
    3.19 受体HUVEC细胞转录组测序及分析
    3.20 小干扰RNA转染
    3.21 统计学分析
4 实验结果
    4.1 分离培养的细胞形态及鉴定
    4.2 外泌体的鉴定
    4.3 细胞对外泌体的内吞实验
    4.4 EXO^HELA对HUVEC细胞增殖的影响
    4.5 EXO^HELA体外对HUVEC内皮细胞层通透性的影响
    4.6 EXO^HELA对HUVEC细胞ZO-1及CLDN5蛋白及MRNA水平的影响
    4.7 EXO^HELA在动物体内增加血管的通透性
    4.8 EXO^HELA减少肺血管紧密连接蛋白水平
    4.9 EXO^HELA在动物体内促进肿瘤的转移
    4.10 EXO^HELA经TRITON X100透膜处理后的功能变化
    4.11 EXO^HELA的MIR测序结果
    4.12 抑制EXO^HELA的MIR成分并不改善HUVEC的紧密连接蛋白
    4.13 EXO^HELA诱发细胞自噬
    4.14 EXO^HELA不通过泛素化导致紧密连接蛋白降解
    4.15 受体HUVEC细胞转录组测序
    4.16 EXO^HELA被HUVEC内吞后部分可向内质网方向聚集
    4.17 EXO^HELA诱导HUVEC发生内质网应激
    4.18 PERK敲减之后能够改善内皮细胞的紧密连接蛋白水平
5 讨论
参考文献
综述
    参考文献
个人简历及在读期间所取得的科研成果



本文编号：3758141