opaque2玉米近等基因系蛋白差异表达研究

  玉米是重要的粮食作物和饲料作物,在我国种植面积居第一位。随着生活水平的提高,人们对其营养品质越来越重视。玉米籽粒氨基酸含量较低,尤其是必需氨基酸赖氨酸含量已经成为限制玉米营养品质提升的一大因素,因此提高玉米的营养价值必需提高籽粒中赖氨酸含量。opaque2突变基因可大幅度提高玉米中赖氨酸含量,但也带来了一些不利影响。为了探究Opaque2(O2)基因在玉米基因组中的的功能,本实验室构建了多对opaque2近等基因系(NILs)材料,并做了一些研究。本实验主要是以本课题前人蛋白质组学的研究为基础,对辽2345与辽2345/o2这对近等基因系组成成分和微观结构、部分差异表达的蛋白点进行研究。主要研究内容如下:1.对辽2345和辽2345/o2近等基因系的成熟籽粒进行营养成分分析,主要包括粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪和总氨基酸含量以及17种主要氨基酸的含量。与辽2345相比,辽2345/o2中粗蛋白、粗脂肪和总氨基酸含量显著降低;17种氨基酸中14种差异显著,尤其赖氨酸含量,在辽2345/o2中为0.507%,比辽2345中提高了76.5%。2.对成熟籽粒和22DAP籽粒的胚乳分别进行了扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)的观察。观察发现,辽2345胚乳淀粉粒角质化、方形或多角型排列紧密,蛋白质鞘状分布于淀粉粒间隙中,籽粒充实度好,密度大,使得其呈现硬质透明表型;辽2345/o2胚乳淀粉粒多裸露、圆形或椭圆形松散排列,基质蛋白散布,籽粒充实度不好,密度小,籽粒呈现粉质不透明表型。3.针对双向电泳(2-DE)中筛选出12个差异蛋白点,对辽2345与辽2345/o2近等基因系在10DAP、14DAP、18DAP、22DAP和26DAP的籽粒胚乳进行了荧光定量分析。结果表明,辽2345/o2中γ-zein前体基因(LOC541920)、丝氨酸羟甲基转移酶基因(Shmt)和丙酮酸磷酸双激酶(Ppdk)的表达量均低于辽2345;泛素结合酶基因(Ubc)、铜锌超氧化物歧化酶基因(Sod4ap)、乳腺谷胱甘肽裂解酶基因(Lgl)和蔗糖合酶基因(Sh1),在14DAP~26DAP表达量均显著低于辽2345;同型半胱氨酸S-甲基转移酶3基因(Hmt3)表达量在18DAP极显著地低于辽2345;双官能团淀粉酶抑制剂基因(Chfi)表达量在授粉后五个时期均显著高于辽2345;豆球蛋白1基因(Leg)在14DAP和22DAP表达量均极显著地高于辽2345;山梨醇脱氢酶基因(Sdh)在14DAP极显著地高于辽2345;ADPG焦磷酸化酶大亚基基因(Sh2)在26DAP极显著高于辽2345。分析认为,OPAQUE2(O2)可能对激活基因LOC541920、Shmt、Ppdk、Ubc、Sod4ap、Lgl、Sh1和Hmt的表达具有促进作用,而抑制Chfi、Leg、Sdh和Sh2的表达。具体的作用机制还有待进一步研究。4.进一步选取淀粉合成途径中的限速酶蔗糖合酶(Su Sy)与ADPG焦磷酸化酶(AGPase)进行了酶活性的测定。结果表明,与辽2345相比,辽2345/o2中Su Sy活性在10DAP和14DAP较高,其他时期较低;而辽2345/o2中AGPase活性在14DAP和26DAP较高,其他时期较低。其他五对NILs材料18DAP胚乳也进行了测定,结果显示D黄212中Su Sy活性低于D黄212/o2,其他NILs均为野生型胚乳中Su Sy活性较高,其中在郑58及郑58/o2间差异不显著;AGPase活性在五对NILs中,均为野生型胚乳中较低,其中在郑58及郑58/o2间差异不显著。分析认为O2可能能够提高Su Sy活性,而抑制AGPase活性。该结果与2-DE的结果基本一致。5.应用酵母双杂交(Y2H)验证O2是否能够与Sh1和Sh2编码产物互作。重组载体p GBKT7-X(X=Sh1,Sh2)分别与p GADT7-O2、p GADT7通过共转化导入AH109后,结果发现Sh1编码蛋白(SH1)具有自激活能力,但是与互作组比作用较弱,O2与SH1可以产生较强互作;Sh2编码蛋白(SH2)无自激活能力,O2与SH2可以产生强互作。6.应用酵母单杂交(Y1H)检测O2是否能够调控Sh1和Sh2转录。重组载体p Lac Zi-Y(Y=Sh1-1,Sh1-2,Sh1-3,Sh1-4,Sh1-5,Sh2-1,Sh2-2,Sh2-3,Sh2-4)分别与p B42AD-O2、p B42AD共转化导入EGY48,通过显色培养发现,Sh1-1、Sh1-2和Sh2-4转化菌株变蓝,O2与Sh1-1,Sh1-2,Sh2-4共转化的菌体也变蓝且颜色更深,说明O2能结合在这些启动片段上,调控Sh1和Sh2的转录。7.结合全文研究结果,分析认为O2蛋白可能促进Sh1的转录表达,使其RNA含量上升,Su Sy含量上升,Su Sy活性升高;同时能够与SH1相互作用。O2可能抑制Sh2的转录表达,使其RNA含量下降,AGPase大亚基SH2含量下降,使AGPase活性降低;同时可以与SH2相互作用。

【学位授予单位】：中国农业科学院

【学位授予年份】：2015
【分类号】：S513;Q943.2
【目录】：

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