高低温下水稻不育系PA64S花药的miRNA表达谱分析
发布时间：2021-08-27 09:06
光温敏核不育系水稻PA64S的育性转换与日照长短和温度高低有密切关系,一般表现为长日、高温条件下不育,短日、低温条件下可育。光敏不育基因pms3等的鉴定揭示了PA64S等光温敏不育系水稻受光周期的影响调控花粉育性的分子机制,但是温度如何参与PA64S育性调控的内在机制尚不明确。本研究拟探讨PA64S孕穗期高、低温条件下miRNA的表达谱差异,筛选PA64S与温敏育性关联的miRNAs及其靶基因,为进一步解析PA64S温敏育性调控的分子机制奠定基础。对PA64S水稻单核期早期花药分别经过30℃（雄性不育）和22℃（雄性可育）处理,构建两个cDNA文库（PA64S-H、PA64S-L）,并进行miRNA高通量测序,对PA64S不同温度下的mi RNA表达谱进行了初步的研究,主要结果如下:1、本研究经不育高温（30℃）和可育低温（22℃）处理两周的孕穗期PA64S水稻花药为材料,Trizol法提取其RNA,琼脂糖凝胶电泳检测提取的样品28S RNA和18SrRNA条带清晰,说明样品RNA降解较少,OD260/OD280比值在1.8-2.2之间说明RNA纯度较高,可用于下一步实验。提取的合格R...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
miRNA作用机制（引自李海明等，2006）[34]
高低温下不育系水稻PA64S花药的miRNA表达谱13技术信息中心(NCBI)的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Rfam(11.0)(RNA家族数据库)的搜索，识别为tRNA、rRNA、snRNA和snoRNA的独特序列。该序列与miRBase中物种的miRNA序列配对(http://mirbase.org/)，以获得样本中已经存在的已知miRNA以及其碱基分布。为了识别PA64S-H和PA64S-L表达差异的miRNA，我们首先对每百万份转录本中miRNA的表达进行了量化。计算P值和褶皱变化，确定表达差异的显著性。差异表达miRNA的标准缺失为|fold-change|>2,P值<0.5。已知miRNA的序列存在miRNA和新的miRNA被用来Patmatch软件预测潜在的靶基因。获得单个样本表达的miRNA靶基因后，我们对该基因部分进行GO(GeneOntology)功能分析和KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenome)通路分析。此外，我们对已知的miRNA和新的miRNA进行靶基因富集分析。图2-1：小RNA信息分析流程（https://www.docin.com/p-2177213616.html）2.2.5实时荧光定量PCR检测差异miRNA以方法2.2.2中的cDNA文库为材料，实时荧光定量PCR来检测两个文库差异miRNA的表达水平，利用Primers软件进行设计的特异性引物，实验中所用的引物均由上海生工公司合成，实验步骤如下：（1）在室温融化2xmiRNAqPCRMix和Reverseprimer（10μM）。
高低温下不育系水稻PA64S花药的miRNA表达谱153结果与分析3.1PA64S水稻miRNA文库样品总RNA的提取及质量检测两系杂交稻温敏不育系PA64S培养至始穗期，经22℃（低于不育起始温度23.3℃，花粉可育）处理两周，取可育的单核小孢子期的花药样品，标为PA64S-L由。经30℃（不育温度）处理两周的不育花药材料做对照（PA64S-H）。由于高通量测序对RNA样品的质量要求较高，因此对所分离的样品总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18SrRNA条带清晰，说明RNA降解较少（图3-1）。再经紫外分光光度计检测。RNA样品的浓度在412-613ng/uL之间，OD260/OD280比值在1.8-2.2之间，OD260/OD230比值大于1.8,28S/18S比值在1.5-2.2之间，符合高通量测序样品的质量标准，用于下一步的测序实验。图3-1：PA64S-H和PA64S-L样品总RNA琼脂糖电泳3.2.PA64S-H和PA64S-L样品测序结果初步分析3.2.1PA64S-H和PA64S-LmiRNA测序文库构建及可读有效序列筛选为探讨PA64S水稻对温度敏感的单核期早期的不育与可育花药之间差异表达的miRNA，我们用经30℃和22℃处理的单核期PA64S水稻花药为材料，分
【参考文献】：
期刊论文
[1]miRNA在水稻产量和胁迫方面的研究进展[J]. 杜思宇,郭国强,洪艳云. 杂交水稻. 2019(06)
[2]浅析水稻杂交育种方法及展望[J]. 李婷婷. 新农业. 2019(21)
[3]光温敏雄性不育水稻的研究进展[J]. 范优荣,曹晓风,张启发. 科学通报. 2016(35)
[4]水稻光温敏核不育系生育期的模拟及预测[J]. 徐建飞,王华,尚博. 农业与技术. 2015(15)
[5]植物miRNA的研究方法概述[J]. 易小娅,杨瑞瑞,曾幼玲. 植物生理学报. 2015(04)
[6]Small RNAs in pollen[J]. HE Hui,YANG TianYu,WU WenYe,ZHENG BingLian. Science China Life Sciences. 2015(03)
[7]杂交水稻育种将迎来新时代[J]. 邓兴旺,王海洋,唐晓艳,周君莉,陈浩东,何光明,陈良碧,许智宏. 中国科学:生命科学. 2013(10)
[8]‘培矮64S’在长沙、海口、南昌三地的育性差异分析[J]. 宁金花,张艳贵,宋忠华. 中国农学通报. 2013(09)
[9]miRNA——一种新的调控基因表达的小分子RNA[J]. 李海明,施南峰. 中国癌症杂志. 2006(08)
[10]水稻光温敏核不育系的光温特性及其熟期性模型研究[J]. 周玉,徐立新,袁潜华,罗越华,姚克敏. 杂交水稻. 2005(04)
本文编号：3366065
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
miRNA作用机制（引自李海明等，2006）[34]
高低温下不育系水稻PA64S花药的miRNA表达谱13技术信息中心(NCBI)的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Rfam(11.0)(RNA家族数据库)的搜索，识别为tRNA、rRNA、snRNA和snoRNA的独特序列。该序列与miRBase中物种的miRNA序列配对(http://mirbase.org/)，以获得样本中已经存在的已知miRNA以及其碱基分布。为了识别PA64S-H和PA64S-L表达差异的miRNA，我们首先对每百万份转录本中miRNA的表达进行了量化。计算P值和褶皱变化，确定表达差异的显著性。差异表达miRNA的标准缺失为|fold-change|>2,P值<0.5。已知miRNA的序列存在miRNA和新的miRNA被用来Patmatch软件预测潜在的靶基因。获得单个样本表达的miRNA靶基因后，我们对该基因部分进行GO(GeneOntology)功能分析和KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenome)通路分析。此外，我们对已知的miRNA和新的miRNA进行靶基因富集分析。图2-1：小RNA信息分析流程（https://www.docin.com/p-2177213616.html）2.2.5实时荧光定量PCR检测差异miRNA以方法2.2.2中的cDNA文库为材料，实时荧光定量PCR来检测两个文库差异miRNA的表达水平，利用Primers软件进行设计的特异性引物，实验中所用的引物均由上海生工公司合成，实验步骤如下：（1）在室温融化2xmiRNAqPCRMix和Reverseprimer（10μM）。
高低温下不育系水稻PA64S花药的miRNA表达谱153结果与分析3.1PA64S水稻miRNA文库样品总RNA的提取及质量检测两系杂交稻温敏不育系PA64S培养至始穗期，经22℃（低于不育起始温度23.3℃，花粉可育）处理两周，取可育的单核小孢子期的花药样品，标为PA64S-L由。经30℃（不育温度）处理两周的不育花药材料做对照（PA64S-H）。由于高通量测序对RNA样品的质量要求较高，因此对所分离的样品总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18SrRNA条带清晰，说明RNA降解较少（图3-1）。再经紫外分光光度计检测。RNA样品的浓度在412-613ng/uL之间，OD260/OD280比值在1.8-2.2之间，OD260/OD230比值大于1.8,28S/18S比值在1.5-2.2之间，符合高通量测序样品的质量标准，用于下一步的测序实验。图3-1：PA64S-H和PA64S-L样品总RNA琼脂糖电泳3.2.PA64S-H和PA64S-L样品测序结果初步分析3.2.1PA64S-H和PA64S-LmiRNA测序文库构建及可读有效序列筛选为探讨PA64S水稻对温度敏感的单核期早期的不育与可育花药之间差异表达的miRNA，我们用经30℃和22℃处理的单核期PA64S水稻花药为材料，分
【参考文献】：
期刊论文
[1]miRNA在水稻产量和胁迫方面的研究进展[J]. 杜思宇,郭国强,洪艳云. 杂交水稻. 2019(06)
[2]浅析水稻杂交育种方法及展望[J]. 李婷婷. 新农业. 2019(21)
[3]光温敏雄性不育水稻的研究进展[J]. 范优荣,曹晓风,张启发. 科学通报. 2016(35)
[4]水稻光温敏核不育系生育期的模拟及预测[J]. 徐建飞,王华,尚博. 农业与技术. 2015(15)
[5]植物miRNA的研究方法概述[J]. 易小娅,杨瑞瑞,曾幼玲. 植物生理学报. 2015(04)
[6]Small RNAs in pollen[J]. HE Hui,YANG TianYu,WU WenYe,ZHENG BingLian. Science China Life Sciences. 2015(03)
[7]杂交水稻育种将迎来新时代[J]. 邓兴旺,王海洋,唐晓艳,周君莉,陈浩东,何光明,陈良碧,许智宏. 中国科学:生命科学. 2013(10)
[8]‘培矮64S’在长沙、海口、南昌三地的育性差异分析[J]. 宁金花,张艳贵,宋忠华. 中国农学通报. 2013(09)
[9]miRNA——一种新的调控基因表达的小分子RNA[J]. 李海明,施南峰. 中国癌症杂志. 2006(08)
[10]水稻光温敏核不育系的光温特性及其熟期性模型研究[J]. 周玉,徐立新,袁潜华,罗越华,姚克敏. 杂交水稻. 2005(04)
本文编号：3366065
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