利用CRISPR/Cas9系统构建甘蓝BoPDS和SRK15基因敲除载体及遗传转化
发布时间：2022-02-15 15:15
甘蓝（Brassica oleracea L.）是我国重要的蔬菜作物,也是世界各国广泛种植的叶用类蔬菜作物之一。我国每年栽培面积可达90万hm2,在蔬菜周年均衡供应中占有重要地位。甘蓝是典型的异花授粉植物且具有显著的杂种优势特点,育种家主要通过自交不亲和系配制杂种一代,但自交不亲和的特点使其繁殖需要蕾期人工授粉,不仅效率低、费时费力、成本高,而且会因自交不亲和造成结实率低产量少的问题,以上因素都严重制约了育种人员对甘蓝农艺性状的改良进程。近年来,CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系统得到了广泛应用,其作为一种新的基因编辑工具,具有操作简单、成本低、周期短的优点,在定向改造植物基因组上表现出了巨大的潜力。目前已经成功实现了在水稻、小麦、拟南芥、烟草等植物中的基因定点编辑,近两年CRISPR系统在甘蓝上也得到了成功应用,但尚不成熟。本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除甘蓝八氢番茄红素脱氢酶BoPDS基因、SRK基因,以期获得基因编辑的甘蓝植株,为建立...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR-Cas结构
利用CRISPR/Cas9系统构建甘蓝BoPDS和SRK15基因敲除载体及遗传转化5列）和Cas基因[39]。CRISPR序列由间隔序列（spacer）和许多保守的重复序列（repeat）间隔串联构成（图1-1），重复序列的长度由23个碱基到50个碱基不等，具有稳定的二级结构和回文结构，间隔序列大多数来源于入侵的病毒和噬菌体，它的作用是将重复序列分开，间隔序列的数量因物种的不同而异；Cas基因家族位于CRISPR序列附近，其具有核酸酶的切割功能并且可以和DNA或者RNA结合，同时能够编码Cas蛋白，用于抵抗外源遗传物质的入侵，crRNA引导Cas蛋白共同参与抵抗外源遗传物质的过程[40]。2011年，Makarova等根据Cas蛋白序列的保守性、组成及在免疫防御过程中对外来遗传物质不一样的应对方式，将CRISPR系统分成I型、II型和III型共三种不同类型[41]，I型和III型系统切割DNA序列时需要多种Cas蛋白一起参与，该过程较为繁琐复杂，II型系统只要求一种Cas9蛋白参与反应即可，组分较为简单，因此，研究者对II型CRISPR系统的认识最为深入，目前应用最广泛的CRISPR/Cas9技术就属于II型CRISPR系统，它的作用原理是：当外源DNA进入细菌时，前导区(Leader)就会调控CRISPR序列转录出pre-crRNA和trans-actingcrRNA(tracrRNA)，随后两者经过加工形成成熟的crRNA，然后crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白形成复合体，这个复合体能够识别和切割含有PAM的外源DNA序列，最终导致外源DNA表达沉默（图1-2）。图1-1CRISPR-Cas结构Fig.1-1ThestructureofCRISPR-Cas图1-2CRISPR/Cas9系统作用机制[92]Fig.1-2MechanismofCRISPR/Cas9system
甘肃农业大学2020届硕士学位论文12靶向能力。最后，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除甘蓝BoPDS基因和SRK基因，将分别修饰两个靶位点的PBSE401-BoPDS-CRISPR表达载体和PKSE401-SRK15-CRISPR表达载体利用农杆菌介导的转化方法侵染甘蓝子叶，对甘蓝BoPDS基因和SRK基因进行编辑，以期获得具有目标性状的基因编辑植株。2.3技术路线图2-1技术路线图Fig.2-1Technologyroadmap
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻植酸合成酶IPK1基因[J]. 李青慧,王丽娜,郑颖媚,孙艳香,陈喜文,陈德富. 南开大学学报(自然科学版). 2019(06)
[2]CRISPR/Cas9技术及其在水稻和小麦遗传改良中的应用综述[J]. 马斯霜,白海波,惠建,吕学莲,陈晓军,李树华. 江苏农业科学. 2019(20)
[3]小麦淀粉分支酶CRISPR/Cas9基因敲除系统gRNA表达载体构建[J]. 李苗,陈晓军,马斯霜,白海波,郑国保,朱金霞,张源沛. 分子植物育种. 2019(20)
[4]CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展[J]. 陈楠楠. 生物化工. 2019(05)
[5]CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因组编辑技术在农作物基因功能中的研究进展[J]. 聂利珍,房永雨. 北方农业学报. 2019(04)
[6]CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用[J]. 谢小东,高军平,李泽锋,张剑锋,魏攀,罗朝鹏,王晨,武明珠,翟妞,杨军. 中国烟草学报. 2019(04)
[7]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻NRR基因促进根系生长的研究[J]. 王海明,张立强,李娜,刘建丰,马崇烈. 杂交水稻. 2019(05)
[8]一种拟南芥基因高效编辑体系研究[J]. 欧阳乐军,马铭赛,陈梓洛,黄嘉玲,布梁灏,陈自银,李莉梅. 植物研究. 2019(06)
[9]利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻负调控抗病基因OsEDR1及基因功能分析[J]. 武广珩,傅仙玉. 应用与环境生物学报. 2019(06)
[10]CRISPR-Cas9系统在蔬菜育种上应用研究进展[J]. 暴会会,尹竹君,王少坤,马瑞红,谢俊俊,张杰,杨正安. 江西农业学报. 2019(07)
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9系统构建葡萄基因敲除载体及遗传转化[D]. 刘月娥.西北农林科技大学 2019
[2]利用CRISPR/Cas9技术创制矮生黄瓜株系[D]. 戚晶晶.南京农业大学 2017
[3]利用CRISPR/Cas9系统定点敲除杨树和烟草PDS基因的研究[D]. 李媛.安徽农业大学 2016
[4]甘蓝型油菜及近缘亲本春化基因VIN3的克隆与进化分析[D]. 罗洁.华中科技大学 2013
本文编号：3626856
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR-Cas结构
利用CRISPR/Cas9系统构建甘蓝BoPDS和SRK15基因敲除载体及遗传转化5列）和Cas基因[39]。CRISPR序列由间隔序列（spacer）和许多保守的重复序列（repeat）间隔串联构成（图1-1），重复序列的长度由23个碱基到50个碱基不等，具有稳定的二级结构和回文结构，间隔序列大多数来源于入侵的病毒和噬菌体，它的作用是将重复序列分开，间隔序列的数量因物种的不同而异；Cas基因家族位于CRISPR序列附近，其具有核酸酶的切割功能并且可以和DNA或者RNA结合，同时能够编码Cas蛋白，用于抵抗外源遗传物质的入侵，crRNA引导Cas蛋白共同参与抵抗外源遗传物质的过程[40]。2011年，Makarova等根据Cas蛋白序列的保守性、组成及在免疫防御过程中对外来遗传物质不一样的应对方式，将CRISPR系统分成I型、II型和III型共三种不同类型[41]，I型和III型系统切割DNA序列时需要多种Cas蛋白一起参与，该过程较为繁琐复杂，II型系统只要求一种Cas9蛋白参与反应即可，组分较为简单，因此，研究者对II型CRISPR系统的认识最为深入，目前应用最广泛的CRISPR/Cas9技术就属于II型CRISPR系统，它的作用原理是：当外源DNA进入细菌时，前导区(Leader)就会调控CRISPR序列转录出pre-crRNA和trans-actingcrRNA(tracrRNA)，随后两者经过加工形成成熟的crRNA，然后crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白形成复合体，这个复合体能够识别和切割含有PAM的外源DNA序列，最终导致外源DNA表达沉默（图1-2）。图1-1CRISPR-Cas结构Fig.1-1ThestructureofCRISPR-Cas图1-2CRISPR/Cas9系统作用机制[92]Fig.1-2MechanismofCRISPR/Cas9system
甘肃农业大学2020届硕士学位论文12靶向能力。最后，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除甘蓝BoPDS基因和SRK基因，将分别修饰两个靶位点的PBSE401-BoPDS-CRISPR表达载体和PKSE401-SRK15-CRISPR表达载体利用农杆菌介导的转化方法侵染甘蓝子叶，对甘蓝BoPDS基因和SRK基因进行编辑，以期获得具有目标性状的基因编辑植株。2.3技术路线图2-1技术路线图Fig.2-1Technologyroadmap
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻植酸合成酶IPK1基因[J]. 李青慧,王丽娜,郑颖媚,孙艳香,陈喜文,陈德富. 南开大学学报(自然科学版). 2019(06)
[2]CRISPR/Cas9技术及其在水稻和小麦遗传改良中的应用综述[J]. 马斯霜,白海波,惠建,吕学莲,陈晓军,李树华. 江苏农业科学. 2019(20)
[3]小麦淀粉分支酶CRISPR/Cas9基因敲除系统gRNA表达载体构建[J]. 李苗,陈晓军,马斯霜,白海波,郑国保,朱金霞,张源沛. 分子植物育种. 2019(20)
[4]CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展[J]. 陈楠楠. 生物化工. 2019(05)
[5]CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因组编辑技术在农作物基因功能中的研究进展[J]. 聂利珍,房永雨. 北方农业学报. 2019(04)
[6]CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用[J]. 谢小东,高军平,李泽锋,张剑锋,魏攀,罗朝鹏,王晨,武明珠,翟妞,杨军. 中国烟草学报. 2019(04)
[7]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻NRR基因促进根系生长的研究[J]. 王海明,张立强,李娜,刘建丰,马崇烈. 杂交水稻. 2019(05)
[8]一种拟南芥基因高效编辑体系研究[J]. 欧阳乐军,马铭赛,陈梓洛,黄嘉玲,布梁灏,陈自银,李莉梅. 植物研究. 2019(06)
[9]利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻负调控抗病基因OsEDR1及基因功能分析[J]. 武广珩,傅仙玉. 应用与环境生物学报. 2019(06)
[10]CRISPR-Cas9系统在蔬菜育种上应用研究进展[J]. 暴会会,尹竹君,王少坤,马瑞红,谢俊俊,张杰,杨正安. 江西农业学报. 2019(07)
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9系统构建葡萄基因敲除载体及遗传转化[D]. 刘月娥.西北农林科技大学 2019
[2]利用CRISPR/Cas9技术创制矮生黄瓜株系[D]. 戚晶晶.南京农业大学 2017
[3]利用CRISPR/Cas9系统定点敲除杨树和烟草PDS基因的研究[D]. 李媛.安徽农业大学 2016
[4]甘蓝型油菜及近缘亲本春化基因VIN3的克隆与进化分析[D]. 罗洁.华中科技大学 2013
本文编号：3626856
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