番茄主要病毒

发布时间：2022-10-08 17:44

　　番茄作为一种重要的经济作物,在世界范围内广泛种植。而番茄病毒病严重限制了番茄的质量与产量。目前对番茄病毒病的主要防治措施有培育抗性品种和使用化学药剂,但是效果均不理想。RNA干扰（RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）引起的序列特异性沉默,它是真核生物中常见的抵抗外源核酸入侵的防御机制。借助基因工程的方法,将含有病毒基因的RNAi载体转化植物,能够获得高抗植物病毒病的转基因植株。但公众对转基因作物安全性的担忧,限制了抗病毒转基因植物的推广应用。开发新的更加安全有效的RNAi载体应用方法有着重要的应用价值和现实意义。RNAi疗法（RNAi therapy）是指通过局部表达某病原的双链RNA,阻断RNA表达蛋白质,治疗相关的疾病的方法。而且RNAi产生的小分子干扰RNA（small interference RNA,siRNA）具有可传递性,因此可以实现系统的基因沉默,类似疫苗的作用,亦可称为“siRNA疫苗”。本研究,在分离鉴定了番茄上主要病毒的基础上,借鉴于“RNAi疗法”的原理,体外构建含多种番茄病毒功能基因的RNAi载体（在植物中表达后可产生... 

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 番茄病毒病的主要种类及危害
        1.1.1 番茄黄化曲叶病毒
        1.1.2 番茄褪绿病毒
        1.1.3 番茄斑萎病毒
        1.1.4 番茄花叶病毒
    1.2 RNAi疗法
        1.2.1 RNAi技术发展
        1.2.2 RNAi技术原理
        1.2.3 RNAi在植物抗病毒中的研究
        1.2.4 RNAi疗法的特点
        1.2.5 RNAi疗法的发展前景
    1.3 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 供试植物
        2.1.2 毒源
        2.1.3 菌株和载体
        2.1.4 酶和常用生化试剂
        2.1.5 实验所用试剂及配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 植物总DNA的提取
        2.2.2 植物总RNA的提取
        2.2.3 引物的设计与合成
        2.2.4 cDNA合成
        2.2.5 重叠PCR构建“siRNA疫苗”载体
            2.2.5.1 目的基因片段的扩增
            2.2.5.2 扩增片段的回收
            2.2.5.3 目的基因连接克隆载体
            2.2.5.4 大肠杆菌感受态制备
            2.2.5.5 连接产物转化大肠杆菌
            2.2.5.6 阳性克隆的PCR鉴定
            2.2.5.7 质粒DNA的提取
            2.2.5.8 质粒酶切与回收
            2.2.5.9 “siRNA疫苗”载体的构建
        2.2.6 农杆菌转化
            2.2.6.1 制备根癌农杆菌感受态
            2.2.6.2 冻融法转化农杆菌
        2.2.7 农杆菌侵染植株
        2.2.8 Northern blot分析
            2.2.8.1 热酚法提取植物总RNA
            2.2.8.2 植物小分子RNA的提取
            2.2.8.3 总RNA电泳
            2.2.8.4 小分子RNA电泳
            2.2.8.5 总RNA的转膜
            2.2.8.6 小分子RNA转膜
            2.2.8.7 合成探针
            2.2.8.8 探针浓度的检测
            2.2.8.9 Northern blot杂交
        2.2.9 实时荧光定量PCR检测病毒含量
        2.2.10 “siRNA疫苗”的抗病毒试验
            2.2.10.1 室内试验
            2.2.10.2 大田实验
3 结果与分析
    3.1 山东省与辽宁丹东番茄病毒病的鉴定结果
        3.1.1 山东省与辽宁丹东番茄病毒病的主要种类
        3.1.2 番茄病毒的检出率
    3.2 TMV“siRNA疫苗”的病毒防效测定
        3.2.1 TMV“siRNA疫苗”的病毒防效
        3.2.2 “siRNA疫苗”处理烟草Northern Blot分析
    3.3 山东主要番茄病毒“siRNA疫苗”载体的构建
        3.3.1 番茄病毒siRNA产生位点的预测
        3.3.2 目的基因片段的扩增
            3.3.2.1 “siRNA疫苗”载体正反向片段的获得
            3.3.2.2 反向目的片段与表达载体连接
            3.3.2.3 正向片段连接重组中间载体
            3.3.2.4 “siRNA疫苗”载体转化农杆菌
    3.4 “siRNA疫苗”抗番茄病毒的室内试验
        3.4.1 “siRNA疫苗”不同浓度处理对病毒的防治效果
        3.4.2 “siRNA疫苗”不同处理方式对病毒防效的影响
        3.4.3 源于病毒不同功能基因的“siRNA疫苗”对病毒防效的影响
    3.5 番茄病毒“siRNA疫苗”的田间防效试验
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]番茄病毒病的发生与防治[J]. 范惠冬,刘燕妮,郑世金,侯柏森,毛芙蓉.  吉林蔬菜. 2019(03)
[2]影响农杆菌转化的植物因素研究进展[J]. 杨柳,于翠梅,刘铭,赵明哲,谢甫绨.  分子植物育种. 2018(23)
[3]基于RNAi的转基因作物研发进展[J]. 张守路,饶力群,汪启明.  现代农业科技. 2018(21)
[4]番茄斑萎病毒病研究进展[J]. 李云洲,默宁,闫见敏,曹贺贺,庞胜群,梁燕.  园艺学报. 2018(09)
[5]番茄黄化曲叶病毒及根结线虫抗性基因的检测[J]. 杨超沙,王国华,吴志明,尹庆珍,尹伟平.  河北农业大学学报. 2018(02)
[6]番茄褪绿病毒在国内外的分布、鉴别方法及粉虱传毒特性的研究进展[J]. 魏可可,李洁,丁天波,褚栋.  中国蔬菜. 2018(01)
[7]番茄黄化曲叶病毒研究进展[J]. 张前荣,李大忠,朱海生,刘建汀,李永平,温庆放.  分子植物育种. 2017(09)
[8]番茄黄化曲叶病毒病的研究进展[J]. 苗相伟.  中国果菜. 2017(03)
[9]油菜花叶病毒山西地黄分离物的全基因组序列测定与分析[J]. 王德富,张西梅,杨锋,牛颜冰.  植物病理学报. 2016(05)
[10]农杆菌侵染条件对柱花草遗传转化效率的影响[J]. 陈彩虹,钏秀娟,王荟,贾艳星,陈志坚,刘国道,罗丽娟.  草业学报. 2016(06)

博士论文
[1]烟粉虱—中国番茄黄曲叶病毒—寄主植物互作关系与营养机制的研究[D]. 刘剑.浙江大学 2009

硕士论文
[1]北方三省区番茄病毒病病原分子鉴定及番茄花叶病毒全基因组序列分析[D]. 杨园园.山东农业大学 2017
[2]番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定、遗传多样性分析及其诱导抗性相关基因的分离[D]. 袁伟.南京农业大学 2012
[3]新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子检测及全序列测定[D]. 姜玉霞.石河子大学 2008



本文编号：3688152