镰刀菌毒素核酸适配体的筛选及分析应用研究
第一章 绪论
镰刀菌是农作物和经济作物的重要病原菌，主要侵染玉米、小麦、大麦、燕麦等多种作物及其加工制品（玉米片、麦芽、啤酒、面包等）。镰刀菌毒素（Fusarium mycotoxin）是镰刀菌生长过程中产生的多种有毒代谢产物，在自然界中分布极为广泛，，是最危险的食品污染物之一，对人畜健康危害十分严重。因此，关于镰刀菌毒素的研究已成为当前国际上最紧迫的课题之一[3]。玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏马菌素（FMs）和 T-2 毒素是主要的镰刀菌毒素[4]，具有重要的食品卫生学意义，后续章节将分别对其进行具体介绍。
1.1.1 污染危害
虽然不同的镰刀菌毒素其理化性质和毒理作用不尽相同，但它们的基本特点是：（1）严重危害人畜健康，可引起脑、肝、肾、皮肤等组织器官或免疫、神经、生殖系统的损伤[5-8]。（2）分子量小、耐热，一旦污染粮食或饲料很难被去除，蒸煮、煎炸等通常的烹调条件对其几乎或根本没有破坏作用[2]。（3）污染对象广泛，常被发现于作为人类食品和动物饲料重要组成的各类作物及其加工产品中[9]。（4）其污染具有高频率发生的特点，在作物的田间生长、收获，粮食或饲料的储藏、加工、运输、销售过程中，均有可能遭受污染。可以说，镰刀菌毒素等真菌毒素的存在，是一种固有的风险[10]，其污染与危害在世界范围内普遍存在。
镰刀菌毒素对人畜健康和社会经济发展的负面影响甚大。其污染可引起作物减产、农产品营养价值下降，导致直接经济损失。据联合国粮食与农业组织（FAO）报告，每年全世界约有 25%的粮食作物受到不同程度的真菌毒素污染，造成的经济损失每年达数千亿美元[11]。在我国，农产品受真菌毒素污染危害更为严重，据统计真菌毒素超标已成为我国农产品出口欧盟的最大阻碍，高于公众熟知的重金属、农药残留、食品添加剂等因素[12]。这其中因镰刀菌毒素引起的经济损失不在少数。此外，当动物摄入镰刀菌毒素污染饲料，会导致生产、繁殖性能下降，动物产品如肉、奶、蛋等品质降低，严重者畜禽因病死亡，给畜牧业带来巨大的经济损失[13]，典型案例即 2008 年美国出现的由于 T-2毒素污染导致的大面积畜禽死亡的现象[14]。当镰刀菌毒素进入人类食物链，可引发人类多种急慢性疾病乃至死亡，导致一系列食品安全事件给全球尤其是发展中国家带来了巨大的间接经济损失，典型案例即二战期间前西伯利亚阿穆尔地区，数千人因进食了被镰刀菌污染的越冬小麦而发生食物中毒。
1.1.2 检测技术
针对真菌毒素引起的食品安全问题，至少 77 个国家制定了食品/饲料中真菌毒素可接受限量的单行法规[13]。我国《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2011）也规定了食品中黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 M1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素 A 及玉米赤霉烯酮的限量指标[15]。就目前国内外的严峻形势而言，加强食品中真菌毒素的检测力度，建立高效快速的检测方法，已成为我国当下防止真菌毒素危害食品卫生安全、保障国际贸易的重要任务。现有的真菌毒素（含镰刀菌毒素）检测方法主要包括以下几种：
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1.2.1 适配体的概述
核酸适配体，简称为适配体（aptamer），是指一段具有特定复杂三维构象的单链寡核苷酸（ssDNA 或 RNA），长度通常在 10-100 个碱基之间，该序列能与靶标分子高亲和力、特异性结合。1990 年，Tuerk 和 Gold[27]提出一种新的体外筛选技术，命名为指数富集的配体系统进化（SELEX，Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment）技术，通过该技术筛选得到了噬菌体 T4 DNA 聚合酶的 RNA 配基。同年，Ellington 和Szostak[28]用类似方法成功筛选到了特异结合活性蓝等有机染料小分子的 RNA 序列，并首次提出“aptamer”的概念，该命名来源于拉丁语 aptus（意为―合适‖）与希腊语 meros（意为“部分”）的组合。
适配体可以与细菌、病毒甚至组织器官等大分子靶标相互作用（图 1-1）；也可以与金属离子、真菌毒素等小分子相互作用（图 1-2）。适配体与其靶标分子高亲和力、特异性结合的原理是：单链寡核苷酸分子能通过链内碱基互补配对形成稳定的二级结构，并在氢键、静电相互作用下发生自身折叠形成复杂的三维结构（如茎、环、发夹、凸环、假结、G-四聚体等结构）[29]，构成与靶分子形状匹配、紧密契合的结构基础；同时，堆叠的芳香环、静电相互作用、范德华力、氢键或者这些影响的综合作用也是适配体与靶分子特异相互结合的原因[30]。
与抗体相比，适配体具有如下优势：（1）亲和力与抗体相当（解离常数 Kd值通常为 nmol/L 或 pmol/L 水平）；特异性甚至优于抗体，抗体常有交叉反应性，而适配体对靶标分子具有高度专一性，能分辨一个甲基或羟基的差异。（2）靶标对象范围比抗原广泛，可包括离子、有机染料、核苷酸、氨基酸、维生素、抗生素、农药、肽类、蛋白质、细菌、病毒、完整细胞、组织甚至器官等，从而适配体的应用范围比抗体更加广泛。（3）初代适配体及迭代适配体的制备均不需依赖动物或细胞免疫，一旦筛选到高特异性、高亲和力的适配体序列，即可通过化学合成法直接制备高纯度的适配体，制备准确性和稳定性远优于抗体；而抗体的制备周期长、生产成本高，制备的不同批次抗体间存在差异。据耶鲁大学研究者 Low 等[32]估计，适配体的生产成本可以比抗体低约 10~50 倍。（4）适配体对溶剂、酸碱度或离子强度具有更好的耐受性，更重要的是具有耐热性，仅需几分钟时间即可实现适配体的可逆变性与复性；而抗体分子的本质是蛋白质，货架期较短，对温度敏感，易遭受不可逆变性而失去用途。（5）易于化学修饰，可标记上生物素、巯基、氨基、荧光染料、抗癌药物等。（6）分子量比抗体小，更易渗透细胞膜进入胞内，利于医学影像诊断和临床治疗。（7）动力学参数可按需要而改变，与靶分子的结合条件可控；而抗体的动力学参数不能被改变，因此抗体的应用不如适配体的灵活、广泛。（8）适配体具有碱基配对等单链核苷酸分子的性质，可通过碱基配对的方法实现亲和力调控，用于设计分子机器、逻辑门等[33]。（9）适配体与靶标分子的结合通常依靠茎环、发夹、假结、G-四联体等特殊的空间三维结构，两者的结合事件（binding events）导致适配体空间构象变化而引发信号变化，为构建基于适配体的生物传感器提供了良好的可行性。
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第二章 玉米赤霉烯酮核酸适配体的筛选与分析应用
1962 年 Stob 等[2]首先从霉变玉米中分离出了 ZEN。该毒素的化学名称为 6-（10-羟基-6-氧基-十一碳烯基）-β-雷锁酸，分子式：C18H22O5，相对分子质量 318.4，化学结构式如图 2-1 所示，难溶于水、易溶于碱性水溶液和醇类，其甲醇溶液在紫外光下呈明亮的绿-蓝色荧光[3, 4]。ZEN 广泛存在于谷物中，主要污染玉米、大麦、小麦、燕麦、高粱和大米等作物，在面粉、麦芽、啤酒及奶制品、肉制品等产品中也有一定程度的分布。ZEN 对人类及动物的健康造成严重威胁，危害仅次于黄曲霉毒素[5]。它对动物具有较强的生殖发育毒性和免疫毒性，可引起动物雌激素亢进症，导致不孕、不育、胎儿畸形和生长发育不良[6]，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来了巨大的经济损失。当 ZEN 通过被污染的作物和肉、奶、蛋等制品进入人体后，对人体危害主要表现为生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性、肝肾毒性，致肿瘤（子宫癌、乳腺癌、睾丸癌）毒性[7,8]。为了控制 ZEN 对人和动物产生的危害，目前世界多国已经制定了针对食品、谷物、饲料中 ZEN 含量的限量标准。例如，我国最新的《GB2761-2011 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定供人食用的谷物及其制品，包括小麦、小麦粉及玉米、玉米面（渣、片）中ZEN的限量指标为60 μg/kg[9]；《GB 13078.2-2006 饲料卫生标准 饲料中赭曲霉毒素 A 和玉米赤霉烯酮的允许量》规定配合饲料、玉米中 ZEN 安全限量为 500 μg/kg[10]。澳大利亚规定谷物中 ZEN 的含量不能超过50 μg/kg，意大利规定在谷物和谷类产品当中ZEN的含量不能超过100 μg/kg，法国规定谷物和植物油中 ZEN 的含量必须低于 200 μg/kg。2011 年，欧洲食品安全管理局下食物链污染物审查组确定了每日耐受摄入量（TDI）为 0.25 μg/kg 体重[11]。因此，建立一种准确、灵敏、快速、经济的 ZEN 检测方法对于保障食品安全、提高贸易竞争力具有重大意义。
当前 ZEN 检测方法主要有薄层色谱法（TLC）[12]、高效液相色谱法（HPLC）[13, 14]、高效液相质谱联用法（HPLC-MS/MS）[15]及基于抗原-抗体免疫识别建立的免疫法等。薄层层析法操作步骤较繁琐，灵敏度及特异性低，已不能满足现代检测的需要。而常用的色谱分析法，样品前处理方法复杂、繁琐，且需要熟练掌握仪器操作技术，不便基层推广。免疫法检测 ZEN 近年来发展迅速，例如 Pei 等[16]利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测中国东北玉米中的 ZEN，检测限为 0. 1 ng/g；Luo 等[17]用胶体金免疫层析法（GICG）测定 ZEN 的检测限为 0.58 ng/mL，可在 5 min 内由肉眼判断结果完成检测；Wang 等[18]建立了一种电化学免疫检测 ZEN 的方法，其检测限为 2 pg/mL；Choi 等[19]发展的荧光偏振免疫检测法（FPIA），检测限达 77 μg/kg，检测时间仅需 3 min；Liu 等[20]利用竞争表面增强拉曼散射免疫检测（SERSI）方法检测 ZEN，其检测限达 1 pg/mL。免疫法虽具有灵敏度高、特异性强等优点，但是小分子半抗原 ZEN 的抗体制备过程繁琐耗时、成本昂贵，不同批次间抗体存在差异性，储存及使用条件严苛，导致假阳性率高、重复性差。
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2.2.1 主要材料与试剂
玉米赤霉烯酮（ZEN）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZOL），伏马菌素 B1（FB1）、伏马菌素B2（FB2），黄曲霉毒素 B1（AFB1）、黄曲霉毒素 B2（AFB2）毒素标准品，羧甲基羟胺半盐酸盐（CMO），碳化二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酸亚胺（NHS），链霉亲和素（SA），丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（29:1）试剂购自 Sigma-Aldrich 公司；Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL），dNTPmix（A、T、C、G 各 25 mmol/L 试剂），10×PCR 缓冲液（包含 Mg2+），GeneRuler Ladder（10-150 bp），过硫酸铵（AP），溴化乙锭（EB）等购自上海生工生物工程技术服务有限公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）购自美国 SAFC公司；Lambda 核酸外切酶（5000 U/mL）、10×Lambda 核酸外切酶反应缓冲液（670 mmol/LGlycine-KOH，25 mmol/L MgCl2，500 μg/mL BSA，pH 9.4）购自纽英伦生物技术（北京）有限公司；TEMED 自美国 SAFC 公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），乙二胺四乙酸（EDTA），吐温 20，牛血清白蛋白（BSA96% ~99%）均购自国药集团上海化学试剂有限公司（上海）；玉米赤霉烯酮商品化 ELISA 试剂盒，江苏苏微微生物研究有限公司；生物素标记的 ZEN 适配体序列及互补短链 DNA 序列，由上海生物工程技术服务有限公司合成；实验中用水均为超纯水（电阻率 18.2 MΩ.cm）。
2.2.2 主要仪器和设备
HH-4 数显恒温水浴锅（常州荣冠实验分析仪器厂），电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），DZF6020 真空干燥箱（杭州同祺仪器有限公司），超声波清洗仪（无锡科洁仪器设备公司），微量分析天平（奥豪斯仪器有限公司），pH 计（奥豪斯仪器有限公司），LDZX-30KBS 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），Centrifuge 5424R台式高速冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司），HH-4 数显恒温水浴锅（常州荣冠实验分析仪器厂），Nicolet Nexus 470 傅立叶变换红外光谱仪（美国 Thermo 公司），C1000Thermocycler 扩增仪（美国 Bio-Rad 公司），Chemi DocTMXRS+凝胶成像仪（美国 Bio-Rad公司），ND-1000 微量紫外可见分光光度计（美国 Nanodrop 公司），MOS-450/AF-CD圆二色谱仪（法国 Bio-logic 公司），F-7000 全波长荧光光谱仪（日本日立有限公司），LSM700 激光扫描共聚焦显微镜（德国 Zeiss 公司），Milli-Q3 Integral 纯水/超纯水一体化系统（密理博（中国）有限公司)。
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3.1 前言....................................................... 47
3.2 实验材料与设备............................................... 48
3.2.1 主要材料与试剂............................................ 48
3.2.2 主要仪器和设备.............................................. 48
第四章 基于适配体特异识别的电化学阻抗谱检测伏马菌素 B1.......... 62
4.1 前言......................................................... 62
4.2 实验材料与设备.............................................. 63
第五章 非固定 GO-SELEX 筛选 T-2 毒素核酸适配体的研究............... 73
5.1 前言........................................................ 73
5.2 实验材料与设备................................................. 74
5.2.1 主要材料与试剂............................................. 74
5.2.2 主要仪器和设备............................................ 75
第六章 基于适配体分离-乙酰胆碱酯酶抑制的T-2毒素可视化检测方法研究
T-2 毒素是 A 类单端孢霉烯族真菌毒素中毒性最强的一种，毒性剧烈且分布广泛，被列为自然界存在的最危险的食品污染源之一，国际上非常重视 T-2 毒素的研究。到目前为止，测定食品或饲料中的痕量 T-2 毒素仍是一个困难的工作[1]。仪器分析法是 T-2毒素检测的一种手段，包括的 LC-MS/MS[2]、UPLC-MS/MS[3]和 GC-MS/MS[4]等。这些仪器为基础的分析方法依赖于昂贵的精密仪器设备和训练有素的人员，也需要包括提取、净化和/或衍生等复杂的样品前处理过程，因此不能普及应用。另一种类型的检测技术是免疫测定法，包括酶联免疫吸附法 ELISAs[5, 6]、基于免疫测定的快速试纸条分析法[7]。免疫测定法灵敏度高，并且可广泛用于大量样品的同时分析。但是，免疫测定法离不开高质量的 T-2 毒素抗体，而抗体的不稳定性可能导致假阳性或假阴性结果的出现。T-2毒素作为一种无偶联活性基团的小分子半抗原，将其与大分子载体蛋白结合制备完全抗原的过程十分繁琐耗时、成本昂贵。因此，开发基于适配体新型识别元件的 T-2 毒素检测方法是形势所需。
上一章中介绍了运用非固定GO-SELEX方法筛选特异识别T-2毒素的高亲和力适配体，得到了一条最佳核酸适配体序列Seq.16。而第四章中，我们利用纳米金电化学性质建立的一种基于适配体识别阻抗检测伏马菌素B1的方法（检测限2 pmol/L）。本实验拟利用纳米金的优秀光学特性，构建一种纳米金比色检测T-2毒素的新方法。纳米金比色法具有其他方法不可比拟的简单快捷、无需复杂仪器、仅靠肉眼就能观察等优点，而且具有特异性和高灵敏性的优点，因此在快速检测领域尤其是食品安全快速筛查领域具有非常广阔的应用前景。但是，纳米金比色法本身也具有缺点，作为一种胶体溶液，容易受到基质环境等影响而发生团聚变色，因此利用纳米金比色法检测食品安全危害因子时，要尽可能去除可能的干扰物。目前，适配体在分离纯化系统中显示出巨大优势，而磁性纳米颗粒生物分离技术日益发展成熟（具体阐述见绪论1.2.3及绪论1.4.1部分），在本文第二章研究中我们已成功将适配体与磁分离富集技术结合建立了特异检测玉米赤霉烯酮的荧光检测方法（检出限785 pmol/L）。
此外，Liu 等[10]还根据杀虫剂对 AChE 酶的抑制作用，建立了一种基于罗丹明 B 标记纳米金的荧光、比色双手段的高灵敏方法，用于检测复杂体系中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留。检测原理是农药能抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，防止催化产物硫代胆碱的生成，阻止纳米金团聚变色。该法对农药西维因、二嗪农、马拉硫磷及甲拌磷的检测最低限分别为 0.1，0.1，0.3 及 1.0 μg/L，具有较高的灵敏度和选择性。在本章实验中，我们将巧妙地利用特异性识别T-2毒素目标物的核酸适配体，将其修饰在磁性纳米颗粒表面制备成捕获探针，完成从复杂体系中分离目标物T-2毒素的过程后，将其重新悬浮于缓冲液中，避免啤酒样品等复杂基质对比色分析实验的干扰。一系列分析验证实验表明，基于适配体Seq.16制备的捕获探针能高效准确地执行从复杂食品基质中捕获目标物T-2毒素的功能，提高检测方法的灵敏度。本方法具有很好的灵敏度，对实际样品检测与 ELISA 方法对照具有很好的一致性。
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主要结论与展望
本论文主要围绕镰刀菌毒素核酸适配体的筛选及其在食品安全检测中的应用展开研究。主要研究结果如下：
1、利用磁珠固定靶标的竞争-SELEX 方法经过 14 轮的筛选富集，获得了特异识别玉米赤霉烯酮的高亲和力 ssDNA 适配体 Z8，其序列为 5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCTATAGTGGCCGCATATCTTTTTTGCGGTCGCTTGGCTCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'，解离常数 Kd= 29±5 nmol/L。通过圆二色谱和二级结构分析适配体上与靶标结合的关键位点是 TAC（CAT）、TAT 及 A=T 碱基对构成的茎结构。以该条特异结合玉米赤霉烯酮的适配体为捕获探针，构建了一种磁分离富集-荧光生物分析检测玉米赤霉烯酮的新方法，在实验优化条件下，玉米赤霉烯酮荧光强度值与其浓度对数值在3.14 nmol~31.4 μmol/L 范围内呈良好的线性关系，检出限为 785 pmol/L，该方法可用于啤酒样品中玉米赤霉烯酮的检测。
2、利用磁珠固定靶标的竞争-SELEX 方法经过 13 轮的严格筛选，获得了特异识别伏马菌素 B1的高亲和力 ssDNA 适配体 F10，其序列为：5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCGATCTGGATATTATTTTTGATACCCCTTTGGGGAGACATCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'，解离常数 Kd为 62±5 nmol/L，为后续检测方法的建立奠定了良好的基础。
3、以伏马菌素 B1的特异识别核酸适配体 apF10 为识别元件，通过恒电位沉积法将纳米金修饰在玻碳电极表面（粒径为 50~100 nm），利用金-硫键作用将巯基化的伏马菌素 B1适配体锚定在纳米金上，建立了一种基于适配体识别的电化学阻抗谱检测伏马菌素 B1的新方法，在实验优化条件下，电化学阻抗变化（Ret）与伏马菌素 B1浓度对数值在 0.1 nmol/L-100 μmol/L 范围内呈良好的线性关系，检出限为 2 pmol/L，该方法可用于玉米样品中伏马菌素 B1的检测。
4、利用免固定靶标的 GO-SELEX 方法，经 10 轮的严格筛选富集到了 T-2 毒素适配体库，富集率为 74%，考察了候选适配体全长序列及截短序列的亲和力与特异性，获得了特异性识别 T-2 毒素的 ssDNA 适配体 Seq.16，其序列为：5'-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGAAGTCGTGCATCTG-3'，解离常数 Kd值为 20.8±3.1 nmol/L。
5、以 T-2 毒素特异适配体 Seq.16 结合磁性纳米颗粒构建高效的捕获探针，从待测样品中分离富集目标物 T-2 毒素，利用 T-2 毒素抑制乙酰胆碱酯酶活性从而阻碍纳米金聚集变色的原理，建立了一种适配体体分离 T-2 毒素抑制乙酰胆碱酯酶的纳米金比色检测 T-2 毒素的新方法，在最优检测条件下得到 T-2 毒素浓度在 107 pmol/L~2145 pmol/L范围内与纳米金溶液吸光度值 A520 nm呈良好的线性关系，检出限为 107 pmol/L，该方法可用于啤酒样品中痕量 T-2 毒素的检测。
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参考文献（略）
本文编号：35125
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/lwfw/35125.html