Sprouty-4对成骨细胞和脂肪细胞分化的作用及机制研究
发布时间：2021-04-11 07:47
目的:基质干细胞（Mesenchymal/stromal stem cells,MSCs）具有多向分化的潜能,既可以向成骨细胞分化,又可以向脂肪细胞分化,其分化过程受内外环境多种因素的影响,且成骨和成脂的分化具有相互制约作用,以达到一个动态平衡态状态。Sprouty（SPRY）是一类在全身组织广泛表达的软脂酰化磷蛋白家族,具有相对保守的序列。研究发现部分SPRY蛋白可能与骨发育过程有关,本研究旨在探究SPRY4对成骨细胞和脂肪细胞分化的作用及其机制。方法:1.通过qRT-PCR技术检测Spry4在野生型小鼠各组织中的表达分布情况;分离并培养C57BL/6J小鼠原代骨髓基质干细胞（BMSCs）,通过qRT-PCR技术检测其向成骨细胞和脂肪细胞分化过程中Spry4的表达变化;2.在骨髓基质细胞系ST2和MSCs中分别过表达Spry4后诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,比较分化水平的差异。3.在ST2和MSCs中分别敲减Spry4后诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,比较分化水平的差异。4.在ST2细胞中过表达和敲减Spry4后,通过免疫荧光及Western blotting技术检测SPRY4对W...
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
过表达Spry4对ST2细胞成脂分化的影响
天津医科大学硕士学位论文 二、Sprouty-4 调控基质干细胞分化机制的研究2.2.2 SPRY4 调控基质干细胞向成骨细胞定向分化的机制研究2.2.2.1 ERK1/2-Wnt 通路参与 SPRY4 对基质干细胞定向分化的调控2.2.2.1.1 过表达及敲减 Spry4 后，免疫荧光检测 β-catenin 入核变化接种 ST2 细胞到 48 孔板内，当细胞汇合度达到 30%左右时进行转染，分别转染 pcDNA3.1-Spry4 进行过表达 Spry4，以及转染 Spry4 siRNA 降低内源性Spry4 的表达水平。转染后 48 h 孵育 β-catenin 一抗以及荧光标记的二抗，最后用 DAPI 染细胞核。荧光倒置显微镜下观察并拍取照片，结果显示，转染pcDNA3.1-Spry4 的实验组与对照组相比，β-catenin 入核减少（图 2.2），说明SPRY4 对 Wnt 信号通路有抑制作用；相反，转染 Spry4 siRNA 后，β-catenin 入核明显增多（图 2.2），说明 Spry4 siRNA 能够激活 Wnt 信号通路，从而进一步说明了 SPRY4 对 Wnt 信号通路起抑制作用。Vector Spry4 Control siRNA Spry4 siRNA
天津医科大学硕士学位论文 二、Sprouty-4 调控基质干细胞分化机制的研究被抑制。相反降低内源性 Spry4 的表达之后，t-β-catenin 及 non-p-β-catenin 蛋白水平则明显升高，表明敲减 Spry4 之后 Wnt 信号通路被激活（图 2.3 A）。之后为了进一步说明问题，我们用核蛋白提取试剂盒提取了核蛋白，通过 Westernblotting 技术检测了核内 β-catenin 和 TCF7L2 的水平。实验结果显示，过表达 Spry4使得核内 β-catenin 和 TCF7L2 的水平下调（图 2.3 B）。相反，降低内源性 Spry4的表达，则使得核内 β-catenin 和 TCF7L2 的水平上调（图 2.3 B）。以上对于t-β-catenin、non-p-β-catenin、β-catenin 和 TCF7L2 的检测结果证明 SPRY4 对 Wnt信号通路有抑制作用。AB
本文编号：3130865
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
过表达Spry4对ST2细胞成脂分化的影响
天津医科大学硕士学位论文 二、Sprouty-4 调控基质干细胞分化机制的研究2.2.2 SPRY4 调控基质干细胞向成骨细胞定向分化的机制研究2.2.2.1 ERK1/2-Wnt 通路参与 SPRY4 对基质干细胞定向分化的调控2.2.2.1.1 过表达及敲减 Spry4 后，免疫荧光检测 β-catenin 入核变化接种 ST2 细胞到 48 孔板内，当细胞汇合度达到 30%左右时进行转染，分别转染 pcDNA3.1-Spry4 进行过表达 Spry4，以及转染 Spry4 siRNA 降低内源性Spry4 的表达水平。转染后 48 h 孵育 β-catenin 一抗以及荧光标记的二抗，最后用 DAPI 染细胞核。荧光倒置显微镜下观察并拍取照片，结果显示，转染pcDNA3.1-Spry4 的实验组与对照组相比，β-catenin 入核减少（图 2.2），说明SPRY4 对 Wnt 信号通路有抑制作用；相反，转染 Spry4 siRNA 后，β-catenin 入核明显增多（图 2.2），说明 Spry4 siRNA 能够激活 Wnt 信号通路，从而进一步说明了 SPRY4 对 Wnt 信号通路起抑制作用。Vector Spry4 Control siRNA Spry4 siRNA
天津医科大学硕士学位论文 二、Sprouty-4 调控基质干细胞分化机制的研究被抑制。相反降低内源性 Spry4 的表达之后，t-β-catenin 及 non-p-β-catenin 蛋白水平则明显升高，表明敲减 Spry4 之后 Wnt 信号通路被激活（图 2.3 A）。之后为了进一步说明问题，我们用核蛋白提取试剂盒提取了核蛋白，通过 Westernblotting 技术检测了核内 β-catenin 和 TCF7L2 的水平。实验结果显示，过表达 Spry4使得核内 β-catenin 和 TCF7L2 的水平下调（图 2.3 B）。相反，降低内源性 Spry4的表达，则使得核内 β-catenin 和 TCF7L2 的水平上调（图 2.3 B）。以上对于t-β-catenin、non-p-β-catenin、β-catenin 和 TCF7L2 的检测结果证明 SPRY4 对 Wnt信号通路有抑制作用。AB
本文编号：3130865
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